CDglyTK自杀基因系统治疗小鼠慢性粒细胞白血病皮下移植瘤的研究

　　作者：姜义荣　　作者单位：东莞市人民医院血液内科, 东莞 523000

　　【摘要】Y为了探讨逆转录病毒介导的CDglyTK自杀基因系统对K562细胞的体内外杀伤作用，将逆转录病毒介导的CDglyTK自杀基因转染入K562细胞，体外实验用MTT法观察5氟胞嘧啶/丙氧鸟苷(5fluorocytosine /ganciclovir， 5FC/GCV)对K562/CDglyTK细胞的生长抑制率。体内实验时将K562/CDglyTK细胞和K562细胞接种于裸鼠皮下，使用GCV和5FC后，观察裸鼠肿瘤体积的变化及裸鼠的生存率。体外实验表明，GCV联合5FC对K562/CDglyTK细胞具有明显的杀伤作用;体内实验结果显示,皮下注射K562细胞和K562/CDglyTK细胞后小鼠成瘤率无明显区别;使用5FC/GCV可明显抑制裸鼠体内的肿瘤形成;经5FC/GCV治疗后K562/CDglyTK组的肿瘤体积较对照组明显缩小，裸鼠生存率也较对照组明显提高。结论：双自杀基因在体内外对K562细胞均有杀伤作用。

　　【关键词】 双自杀基因 CDglyTK自杀基因 慢性粒细胞白血病 K562细胞 逆转录病毒载体 5氟胞嘧啶 丙氧鸟苷

　　Abstract The aim of study was to investigate the killing effect of double suicide gene system mediated by retroviral vector on K562 cells in vivo and ex vivo. CDglyTK gene was transfected into PA317 cells by using lipofectamine. K562 cells were infected with viral supernatant. K562 /CDglyTK cells were treated with 5fluorocytosine (5FC) and/or ganciclovir (GCV). Mice were randomly divided into three groups: tumor formation， tumor inhibition and tumor therapy. Each mouse was implanted with K562/CDglyTK cells or K562 cells. The results indicated that the killing effect of 5FC in combination with GCV on K562/CDglyTK was more significant than using 5FC or GCV alone. In vivo study showed that after being injected subcutaneously with K562 cells and K562/CDglyTK cells, there was not obvious difference in tumor formation rate of mice, 5FC+GCV could suppress tumor formation of the K562/CDglyTK cells. After being treated with 5FC and GCV, the median tumor volume of mice implanted with K562/CDglyTK cells decreased obviously, compared with the control group. Their median survival was significantly prolonged. It is concluded that double suicide genes are more effective for killing effect on K562 cells in vivo and in ex vivo. It may be applicable to clinical gene therapy.

　　Key words double suicide gene; CDglyTK suicided gene; CML; K562 cell; retroviral vector; 5fluorocytosine; ganciclovir

　　J Exp Hematol 2007; 15(1):47-51

　　慢性粒细胞白血病是一种常见的血液系统恶性肿瘤，造血干细胞移植是目前唯一可以根治的手段，但由于寻找合适的供者比较困难、移植相关的死亡率高、费用昂贵等原因尚不能广泛开展，因此人们在寻找新的治疗方法。近年来恶性肿瘤基因治疗的迅速发展使其成为肿瘤治疗领域的热点[1-3]。本研究观察逆转录病毒介导的CDglyTK自杀基因系统对K562细胞的体内外杀伤作用，以期为治疗慢性粒细胞白血病提供一种新的思路和方法。

　　材料和方法

　　细胞及试剂

　　大肠杆菌DH5α为山东大学血液研究室保存， 重组逆转录载体 pWZLneoCDglyTK 由山东大学血液研究室刘春生教授构建。K562细胞为山东大学血液研究室保存，BALB/c裸鼠购自中山大学实验动物中心，脂质体(LipofectaminTM)为Gibco BRL公司产品，2'脱氧链霉胺(G418)(商品名geneticin)、多聚赖氨酸(PLL)、聚凝胺为Sigma公司产品， GCV、5FC为Roch Syntex公司产品，RNA提取试剂盒为TaKaRa公司产品，各种限制性核酸内切酶、聚合酶、随机引物Oligo(dT)15购自Promega公司，PCR扩增引物由上海生工生物技术公司合成。引物序列如下： CD 上游引物 P1： 5′ GTGAATTCAGGCTAACAGTGT CGAATAACGCT 3′，下游引物P2：5′GTGGATCCTCAACGTTTGTTA ATCGATGGCTTC 3′;TK 上游引物 P1：5′GCGCGT ATGGCTTCGTACCC 3′， 下游引物P2：5′TCCTTG CGTGTTTCAGTTAG 3′。

　　使用脂质体按照操作说明书进行转染，将PA317细胞接种于多聚赖氨酸(PLL)处理后的培养皿中，当细胞有60%汇合的时候，在脂质体的介导下将pWZLneoCDglyTK转入PA317细胞，24-48小时后加入G418选择培养， 3天后换为不含G418的正常培养液培养;此后每1-2天换液1次，15-20天后出现PA317筛选克隆，继续以含有G418的选择培养液培养，得到单克隆产病毒细胞株PA317/CDglyTK ，大量培养扩增PA317/CDglyTK细胞，收集病毒上清。透射电镜下观察包装细胞上清中的病毒颗粒。收集的病毒上清离心、过滤。将多聚赖氨酸加入过滤后的病毒上清，混匀后低温、高速离心2小时，弃上清，少量培养液重溶病毒颗粒沉淀，分装备用或立即使用。病毒滴定度测定按照参考文献[4]所述的方法进行。

　　逆转录病毒对K562细胞的转染及鉴定

　　取5×105 K562细胞接种于75 ml培养瓶中，培养24小时后分别加入浓缩病毒100 μl，聚凝胺(polybrene)1.6 μl，培养3小时后续加培养液，继续培养24-48小时后，RTPCR鉴定K562细胞中CDglyTK的表达情况：用RNA抽提试剂盒提取病毒感染后K562细胞RNA，以OligodT为引物进行逆转录，并取0.5μg逆转录产物分别对CD、TK进行PCR扩增，扩增片段的长度分别为1.31 kb、1.19 kb。观察结果并拍照。

　　GCV和5FC对K562细胞的细胞生长抑制率的MTT法测定

　　分别取104 个K562/CDglyTK细胞及K562细胞各分3组接种于96孔板：GCV组，5FC组，GCV与5FC组，按照不同的浓度梯度(GCV：0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 μg/ml;5FC：20、40、60、80、100、120 μg/ml)分别加入96孔板，每个浓度设4个复孔，以未行任何处理的K562细胞为空白对照组。培养4天后测定吸光度(A值)。细胞生长抑制率(GIR)按下式计算:

　　GIR=(1-实验组A值/空白对照组A值)×100%

　　慢性粒细胞白血病皮下移植瘤模型的建立

　　BALB/c裸鼠10只，随机分为2组，每组5只，1组皮下注射2×106个K562细胞，另1组皮下注射2×106个K562/CDglyTK细胞。小鼠在无菌笼中饲养，观察其成瘤情况。

　　自杀基因在裸鼠体内抑瘤效应的观察

　　将20只裸鼠随机分为A、B、C、D 4组，每组5只，其中A组为对照组，B、C、D组为实验组，将2×106个K562/CDglyTK细胞分别接种至实验组裸鼠背部皮下，同时将2×106个K562细胞皮下注射给对照组裸鼠。注射细胞的第2天，给B组小鼠腹腔内注射GCV(50 mg/kg)，给C组小鼠腹腔内注射5FC(300 mg/kg)，给D组小鼠腹腔内注射GCV(50 mg/kg)和5FC(300 mg/kg)，每日1次，连续注射21天;给对照组裸鼠腹腔内注射生理盐水，注射体积均为0.2毫升/只。观察各组肿瘤形成情况。30天时用游标卡尺测量形成肿瘤的两个垂直方向的最大和最小直径，肿瘤体积计算公式[6]：V=ab2/2，其中a代表最大直径，b代表最小直径，单位为mm。

　　自杀基因对裸鼠体内肿瘤的治疗作用

　　将20只裸鼠随机分为A、B、C、D 4组，每组5只，其中A组为对照组，B、C、D组为实验组，将2×106个K562/CDglyTK细胞分别接种至实验组裸鼠背部皮下，同时将2×106个K562细胞皮下注射对照组裸鼠。接种后2周，当肿瘤直径达到50-90 mm时，开始给予GCV和5FC治疗，B组小鼠腹腔内注射GCV(50 mg/kg)，C组小鼠腹腔内注射5FC(300 mg/kg) ，D组小鼠腹腔内注射GCV(50 mg/kg)和5FC(300 mg/kg)，每日1次，连续注射21天;对照组裸鼠腹腔内注射生理盐水，注射体积均为0.2毫升/只。分别在治疗开始后第5、10、15、20天用游标卡尺测量的两个垂直方向的最大和最小直径，按上节所述公式计算肿瘤体积。观察各组裸鼠肿瘤大小及生存期。

　　统计学处理

　　数据用SAS软件进行统计学处理，组间数据比较采用方差检验。

　　结 果

　　逆转录病毒的包装及鉴定

　　用脂质体将双自杀基因CDglyTK转移至包装细胞PA317中，以G418 600 μg/ml对基因转染的PA317细胞进行选择培养，15-20天后获得抗性克隆PA317/CDglyTK。在透射电镜下观察到病毒颗粒散在或聚集成堆，呈圆球形，直径约100 nm大小。经测定所获得的浓缩逆转录病毒的滴定度为5×106 cfu/ml。

　　目的基因在K562细胞中整合及鉴定

　　提取K562/CDglyTK的RNA，对CDTK行RTPCR扩增，结果于1.31 kb和1.19 kb处各有一阳性条带(图1)，说明目的基因已整合入K562细胞且稳定表达。

　　Figure 1. Gel electrophoresis result of RTPCR products for double suicide genes. M: marker(DL2000). Lane 1:CD. Lane 2: TK.

　　5FC/GCV对K562细胞的杀伤作用

　　K562/CDglyTK未使用GCV和5FC时，光学显微镜下观察细胞的生长状态与未转染自杀基因的K562细胞无区别，说明基因转染对细胞无影响。单独使用GCV或5FC组，K562 /CDglyTK的细胞GIR分别为49.35%、42.32%，较未转染K562细胞的GIR(0%)明显升高，有显著性差异(q=42.77、q=44.20，P<0.01)，但两个单用药组之间比较无明显差别(q=1.44，P>0.05);K562/CDglyTK的GCV和5FC组的细胞GIR为86.17%，与K562/CDglyTK的GCV组或5FC组比较明显升高，有显著性差异(q=39.11、q=37.68，P<0.01)。

　　小鼠慢性粒细胞白血病皮下移植瘤模型的建立

　　接种K562细胞和K562/CDglyTK细胞的2组裸鼠分别在(6.9±1.3)天和(7.0±0.8)天后均长出肉眼可见的瘤块。裸鼠皆表现出不同程度的进食减少、攻击性减弱、动作迟钝。接种K562细胞组小鼠生存期为(54.18±4.3)天，接种K562/CDglyTK细胞组裸鼠生存期为(55.08±3.7)天。两组裸鼠生存期无显著差异(P>0.05)。裸鼠肿瘤体积最大达到518 mm3。实验结果显示，成瘤率为100%，接种K562细胞和K562/CDglyTK细胞形成的小鼠慢性粒细胞白血病皮下移植瘤模型是稳定的，导入外源CDglyTK基因并不影响K562细胞的致瘤性，也不影响肿瘤模型的稳定性。

　　自杀基因的抑瘤作用

　　对照组裸鼠皮下接种K562细胞后(6.9±1.7)天长出肉眼可见的肿瘤，如绿豆大小，30天后肿瘤体积达到(930±140)mm3，B、C组裸鼠接种后(25.7±1.3)天、(24.5±1.6)天长出肉眼可见的肿瘤，30天后肿瘤体积达到(60±8)mm3、(71±5)mm3，D组裸鼠接种后30天仍未见肿瘤生长。

　　Figure 2. Antitumor effect of suicide gene therapy system on mice bearing K562 cells.

　　自杀基因对缩小肿瘤体积的治疗作用

　　各组裸鼠肿瘤体积的变化如图2所示。实验组裸鼠肿瘤体积较对照组明显缩小，差异显著，D组裸鼠与B组、C组裸鼠比较肿瘤体积缩小差异显著，说明双自杀基因治疗效果优于单自杀基因。各组裸鼠存活率如图3所示，实验组各组裸鼠存活率显著高于对照组(χ2=4.62，P<0.05)，D组(GCV和5FC治疗组)裸鼠存活率(80%)显著高于单纯GCV治疗组(40%)或5FC治疗组(35%)，差异显著(χ2=11.55，P<0.05)。

　　Figure 3. Survival effect of suicide gene therapy system on mice bearing K562 cells.讨 论

　　尽管肿瘤的诊断和治疗水平不断提高，但每年因肿瘤致死的病人仍居高不下。传统的手术治疗、放疗、化疗对早期的肿瘤有较高的治愈率，但对肿瘤的复发、转移、晚期肿瘤则束手无策，而且会产生较大的毒副作用。近年来，广为研究应用的是自杀基因治疗(suicide gene therapy)[7]，又称为病毒介导的酶前药治疗，它是将自杀基因导入肿瘤细胞，而将无毒性的前体药物(GCV和5FC)在肿瘤细胞内代谢为毒性代谢产物，进而杀伤肿瘤细胞。将外源基因转入靶细胞即基因转移是基因治疗的基础和关键步骤。有许多种方法，其中研究应用最多的是病毒载体介导法。本研究选用逆转录病毒作为载体，构建了将CDglyTK双自杀基因转染入K562细胞的载体系统。逆转录病毒载体由于具有以下特点而成为目前应用最多、研究最为广泛的转移载体[7，8]：①具有整合信号，能将外源基因整和至宿主细胞基因组,并能稳定存在而不丢失; ②外源基因整和的拷贝数只有一个; ③逆转录病毒只选择性感染分裂期细胞，较适合于肿瘤的基因治疗;④重组病毒可以携带外源基因的DNA长度达8 kb; ⑤逆转录病毒载体已发展到第4代，在体内重组产生野生型病毒的机会少，安性较大。在既往的基因治疗中，难以逾越基因转导效率低和缺乏特异性两大障碍限制了自杀基因治疗的进一步推广使用。为了克服上述障碍，近年来趋向于采取双自杀基因联合治疗。Rogulski等[9]实验表明，转导CD/HSVTK融合蛋白(CDglyTK)，通过CD、HSVTK酶测分析显示其有双重功效，比单用CD/5FC或HSVTK/GCV系统更敏感，更有效。本研究表明，单独使用GCV或5FC时，K562/CDglyTK的细胞GIR分别为49.35%、42.32%，与未转染自杀基因的K562细胞组比较，细胞GIR显著升高，但两个单用药组之间比较无明显差别;K562细胞/CDglyTK的GCV和5FC组的细胞GIR为86.17%，与K562细胞/CDglyTK的GCV组或5FC组比较，细胞GIR显著升高，差异显著，说明双自杀基因的杀伤力较单自杀基因明显增强。本研究在体外实验的基础上，将在逆转录病毒介导下转染CDglyTK的K562细胞种植于裸鼠皮下，进一步观察自杀基因对肿瘤的抑制作用和治疗作用。在皮下移植瘤尚未形成时，联合使用GCV和5FC可明显抑制皮下移植瘤的形成，接种30天后仍未见肉眼可见的肿瘤，肿瘤抑制率为100%;双自杀基因体系对裸鼠慢性粒细胞白血病皮下移植瘤的治疗作用也很明显，K562/CDglyTK细胞接种裸鼠成瘤后，腹腔内连续应用前体药物(GCV和5FC)3周，70%裸鼠肿瘤会逐渐缩小、消退，荷瘤裸鼠存活期延长，存活率达80%。结果表明双自杀基因对K562皮下移植瘤具有较好的治疗作用，为进一步应用于临床奠定了基础。

　　【参考文献】

　　1Painter RG, Lanson NA Jr, Jin Z, et al. Conditional expression of a suicide gene by the telomere reverse transcriptase promoter for potential posttherapeutic deletion of tumorigenesis. Cancer Sci， 2005; 96: 607-613

　　2Zarkowska T. Cancer gene therapy — first international conference. 8-9 July 1999, Hammersmith Hospital, London, UK Drugs， 1999; 2: 877-881

　　3Ikegami S, Tadakuma T, Yamakami K, et al. Selective gene therapy for prostate cancer cells using liposomes conjugated with IgM type monoclonal antibody against prostatespecific membrane antigen. Hum Cell， 2005; 18: 17-23

　　4奥斯伯, 布伦特, 金斯顿等著(颜子颖、王海林译). 精编分子生物学实验指南.北京：科学出版社. 1998：317-320

　　5Black ME, Kokoris MS, Sabo P, et al. Herpes simplex virus1 thymidine kinase mutants created by semirandom sequence mutagenesis improve prodrugmediate tumor cell killing. Cancer Res, 2001; 61: 3022-3026

　　6O'Relly MS， Boehm T，Shing Y，et al. Endostatin:an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth.Cell,1997; 88： 277-285

　　7Nagy HJ, Panis Y, Fabre M, et al. Suicide gene therapy of ovrian cancer: an experimental study in rats using retroviralmediated transfer of herpes simplex virus thymidine kinase gene. Anticancer Res, 2000; 20: 4633-4638

　　8Hedfors IA, Beckstrom KJ, Benati C, et al. Retrovirus mediated gene transduction of human Tcell subsets. Cancer Immunol Immunother， 2005; 54: 759-768

　　9Rogulski KR，Kim JH, Kim SH, et al. Glioma cells trasduced with an Escherichia Coli CD/HSV1 TK fusion gene exhibit enhanced metabolic suicide and radiosensitivity. Hum Gene Ther, 1997; 8: 73-85