免疫性血小板减少性紫癜动物模型的研究进展

　　作者：张爱军,侯明　　作者单位：山东大学齐鲁医院血液科，济南 250012

　　【摘要】免疫性血小板减少性紫癜(immune thrombocytopenic purpura，ITP)是一种较为常见的自身免疫病，其临床试验多建立于临床药物的应用，而非亚临床研究，有可能因为意外并发症被迫中止，因此建立理想的动物模型有助于加深对ITP发病机制和用药机理的理解。本综述回顾了ITP模型的发展过程，总结了被动型和主动型造模方法在ITP研究中的应用，尤其是转基因小鼠可更好模拟人类疾病病理状态，有利于进一步探讨新的诊断和治疗方法。

　　【关键词】 免疫性血小板减少性紫癜

　　Abstract Human ITP clinical trials have been performed based on observations of clinical uses of drugs，other than on mechanism studies in preclinical models，many studies were stopped because of unexpected complications. So there was need to develop ideal animal model of ITP to improve the understanding of the pathophysiology and the mechanisms of action of therapeutics. In this review，the history of animal models of ITP was retrospected，two modeling methods inducing passive and active models，especially transgenic rice model which can more accurately represent human disease pathophysiology，and their application in study of ITP were summarized. An animal model for human immune thrombocytopenia allows detailed studies of the mechanism，kinetics，and therapy of human immune thrombocytopenia.

　　Key words immune thrombocytopenic purpura; autoantibody; animal model

　　目前人类免疫性血小板减少性紫癜(immune thrombocytopenic purpura，ITP)的临床试验多建立在临床药物应用的基础上，而不是亚临床研究。这样的试验有可能因为出现意外并发症而被迫中止[1，2]，因此建立理想的动物模型有利于加深对ITP治疗药物机理和发病机制的理解，并进一步探讨新的诊断方法和治疗方法。一个理想的动物模型应该能复制出ITP的所有方面，如它的易感性、临床过程和组织病理，同时也应该容易建立、具有可操作性和稳定性[3]。数十年来，已有众多的造模方法应用于ITP的研究，为ITP基础和临床研究不断进展提供了平台。

　　被动型的病理模型

　　此造模方法是：将致病的抗体注射入受体动物体内，然后观察其效应。被动型的ITP病理模型建立的早期，主要是通过体内给予多克隆抗血小板抗体，依赖抗体的剂量导致血小板数量的一过性减少。

　　抗血小板血清(APS)造模方法

　　1905年Marlno率先用兔血小板免疫豚鼠，制取豚鼠抗兔血小板抗血清，并以此抗血小板血清输入兔体内造成血小板破坏形成血小板减少模型，以研究紫癜形成与血小板减少的关系。1913年，LeSourd等开始用反复输注抗血小板血清(APS)的方法造模得到骨髓中巨核细胞数量增加的血小板减少模型，来研究巨核细胞与血小板的关系。1951年，Harrington等[4]将ITP患者血浆输给正常人造成受者血小板减少，从而揭示了ITP免疫发病学本质是循环中存在抗血小板因子而引起血小板减少。 至此，用免疫法造成的血小板减少动物模型开始应用于ITP的实验研究。

　　自上世纪80年代，造模动物多为纯系小鼠所取代，同位素标记技术、骨髓和脾巨核细胞培养技术以及流式细胞仪的应用，使人们对血小板产生的调节因素及其与巨核细胞之间的关系有了新的认识。用有微环境损伤的S1/S1小鼠和有严重多能干细胞缺陷的w/w小鼠造模[5]，通过对该模型停止注射抗血清后，观察有无血小板反馈性增高。发现这种造血调节是发生在各系祖细胞水平而不是多能干细胞水平。利用I标记葡萄球菌蛋白A(SPA)测定血小板相关抗体PAIgG及ln标记血小板测定其寿命，均证实了免疫法所造动物血小板减少模型具有骨髓中巨核细胞增多、PAIgG增高、血小板寿命缩短等特性，与ITP临床表现相符。Ebbe等[6]用缺乏胸腺细胞的裸鼠造模，试图揭示ITP发病与细胞免疫之间的关系。结果显示，在急性免疫性血小板减少刺激下血小板生成是正常的，巨核细胞大小和血小板的产生与Meg-CFC、GM-CFC和BFU-E均无关。补充正常T细胞并不影响血小板的生成，但能加强模型对APS反应。

　　APS免疫法造模除了通过加热灭活补体外，还需采用多种细胞和组织吸附APS来去除抗红细胞、抗白细胞和抗组织的抗体，使模型除血小板减少外其它细胞组织不受影响。免疫法造模具有造模原理简单、干扰因素小、有明确血小板抗体产生等优点，曾一度被国内外广泛应用。虽然人们选择不同的动物种系设计模型，但终因该模型血小板抗体是外源性的，需不断输入APS才能维持血小板减少状态，维持慢性ITP稳定性相对要差，目前已较少采用[7]。

　　多/单克隆抗体造模方法

　　目前，多/单克隆抗鼠血小板抗体已经广泛应用于被动型的病理小鼠模型，它们引发与临床和病理表现相同或相近的反应，但多用于研究药物的作用机理，近年来也用于新药的开发及疗效的验证。

　　Teeling等[8]对雌性C57BL/6小鼠进行大鼠抗GPⅡb/Ⅲa单克隆抗体-MWReg30腹腔注射，单次大剂量注射后小鼠循环血小板数量在3小时内迅速下降，几乎为零，经眼镜蛇蛇毒因子预处理也不能影响血小板的消耗，而给予抗FcRⅡ/Ⅲ单克隆抗体及IVIG预处理的小鼠则能够明显减少血小板的清除;连续小剂量输注的小鼠则在4天后下降到一个相对稳定的水平，其血小板量约为正常对照组的25%，而这种下降在缺乏FcR链的小鼠(分别为FcRI、FcRIII和 FcRIII缺失)却没有观察到。

　　Song等[9]通过给SCID小鼠腹腔内分别注射大鼠抗GP-Ⅱb抗体-MWReg30和抗GP-Ⅲa 抗体-2C9.G2诱导产生ITP，未经IVIG预处理的小鼠在24小时即出现血小板减少，而经过IVIG 预处理的小鼠则明显受到保护，同时还验证了单克隆抗体anti-TER-119 和anti-CD24 (IgG2b)对小鼠ITP的治疗作用。在这项实验中，作者为了避免因IVIG及治疗性单克隆抗体引起的免疫反应而应用SCID小鼠，然而事实上在BALB/c和CD-1小鼠中也观察到了相同的结果。

　　目前尚无商品化的产抗大鼠血小板单克隆抗体的细胞，因此Hansen等[10]采用产鼠抗人血小板单克隆抗体-7E3的杂交瘤细胞给BALB/c 小鼠进行腹腔内注射，产生鼠抗人GPⅡb/Ⅲa IgG1抗体，其诱发的可重复的、严重的血小板减少及出血，与临床表现一致，但这种急性被动型模型仍然是通过给予外源性抗体造成血小板减少，还不能十分精确地模拟人体ITP的状态。

　　此后Hansen等[11]又采用Sprague-Dawley大鼠以上述方法造模，观察IVIG的剂量依赖效应。在这一急性模型中，血小板减少仅在前24小时观察到，最明显的影响在最初3小时内，因此如果IVIG在慢性ITP中可加速抗血小板抗体的清除，那么可以考虑其中有其它因素在发挥作用，且可能更直接控制血小板破坏的其他方面，如干扰Fc或补体介导的血小板破坏等。

　　应当说，这类特异性抗血小板抗体造模方法较之免疫法更能模拟ITP的病理状态，但仍不能揭示其完整的发病机制，而对于研究IVIG，anti-D等药物的作用机理，这种造模方法不失为一种有效的可控性强的途径。

　　总的来说，被动型病理模型的优点是，特定的抗体抗原关系是已知的，能够引起血小板数量的暂时变化;其缺点在于，不能较好地模拟人ITP的病理状况。人体中ITP发病机理是多克隆内源性血小板抗体不断地在体内生成和循环，并发生作用的，被动型动物模型难以达到持续产生抗体的要求，故不适用于自身免疫反应的启动及调节机制的研究。

　　主动型的病理模型

　　此造模方法是使动物的自身免疫系统产生致病性抗体。这种免疫反应可以是自发的，也可以通过抗原产生。

　　日本学者[12]发现一种具有迟发红斑狼疮倾向的(NZW*BXSB)F雌性小鼠。成年后逐渐出现血小板减少、巨核细胞增多，但形态正常，PAIgG升高，血小板寿命缩短，抗心磷酯酶抗体增高，这些表现符合ITP临床特点。利用此模型进行异基因骨髓移植治疗，发现对于血小板减少确有预防和治疗作用。对该模型进行强的松龙重复注射后，血小板明显增多，血小板寿命延长，PAIg下降，这一研究证实了皮质类固醇治疗ITP机理或是抑制网状内皮系统吞噬功能，或是抑制了血小板抗体的产生。但此种模型缺陷是同时伴有狼疮肾及心肌梗死，且存在多种自身抗体，表现为多种自身免疫病，干扰因素大，这无疑增加了分析的难度。

　　最近Musaji等[13]用大鼠的血小板免疫CBA/Ht小鼠，使小鼠发生血小板减少，并在其体内检测到抗血小板GPⅠb的自身抗体，成功建立了免疫性血小板减少的模型。但该模型维持时间仍较短，约5周，且为异种血小板免疫，特别适用于输血后紫癜的研究，对自身免疫性血小板减少性紫癜，尤其是慢性ITP它仍不是一种较为理想的动物模型。

　　在20世纪90年代，主动型病理模型遇到了很多障碍。人类和小鼠各自都有吞噬细胞Fcγ受体，通过亚单位FcR γ链的转导信号，可以调节抗体包被的血小板的清除[14]。小鼠被敲除了鼠类的FcR γ-链基因，接受抗血小板抗体注射后并不出现血小板减少[15]。试验证实，对于ITP来说血小板抗体是必需的，但是仅有它是不够的。功能性的吞噬细胞Fcγ受体也是必需的[16]。然而，已经证实人类和小鼠的所有FcR γ-受体的组成有非常大的差别。特别是，人类具有的FcR γ-的基因组正是小鼠基因组缺少的，两者在Fcγ受体的最主要的不同在于FcγRIIa，小鼠中没有FcγRIIa基因。FcγRIIa是表达于人类的血小板和粒细胞的，FcγRIIa基因在灵长类进化中出现，FcγRIIa基因的同源基因在其他哺乳动物和其他灵长类动物中是缺失的[17]。因此，在小鼠中抗体介导的血小板破坏的详细机制能否正确反映人体内的情况尚无定论。

　　转基因动物造模

　　用动物模型研究人类疾病的有效性是动物模型选择的最重要的标准。因此应通过实验，对各方面因素进行合适的调整，建立一个理想的、稳定的、最大程度模拟人体的模型。模型同时也应该是容易建立且具有可操作性，因此啮齿类动物成为应用最多的动物。但人鼠毕竟存在遗传学的极大差异，所以可借助于实验手段来控制实验动物的特定基因组分及其表达等，使动物表现特有的遗传性状，运用此技术干预的动物称为转基因动物。

　　目前已有成功建立的FcγRIIa转基因小鼠模型，在小鼠血小板和淋巴细胞上表达了和人相同生理水平的FcγRIIa。在被动的ITP小鼠模型中，证明FcγRIIa基因在免疫性血小板减少中扮演了重要的角色[18]。试验中，小鼠血小板GP的单克隆抗体被注入野生小鼠体内后引起了免疫性血小板减少症。Clynes等[19]观察到敲除FcγR链的小鼠血小板数量没有减少。FcγRIIa转基因小鼠当注射了血小板抗体后也出现了明显的血小板减少症。此外，FcRγ-链敲除后，FcγRIIa基因及其自身能够介导明显的免疫性血小板减少症[20]。由此得出结论，如果想让鼠类免疫性血小板减少症的模型能够更精确地模拟人类的疾病的情况，FcγRIIa基因一定要存在[21]。

　　最近，McKenzie等[22]首创性地将人类FcγRIIa基因转导入自发自身免疫的主动型ITP模型(W/BF1)中。雌性NZW鼠同BXSB雄性鼠相交配后，雄性F1发生了系统性自身免疫性疾病，系统性自身免疫性疾病，包括继发于血小板自身抗体的免疫性血小板减少症。杂交第一代小鼠的免疫性血小板减少症能够通过脾切除得到改善。血小板减少在杂交第一代雄性带有FcγRIIa基因表达的小鼠中比缺少FcγRIIa基因表达的小鼠表现更为严重。

　　McKenzie等[23]还将FcRIIA 转基因鼠与 FcR 敲除小鼠进行交配，检测FcRIIA在FcRI 及FcRIII缺失的情况下发挥的免疫清除作用，结果出现严重的免疫性血小板减少，证实了FcRIIA在体内免疫清除中发挥着重要作用。除外先前在被动动物模型中的描述，这些在主动型动物模型中的结果证实，FcγRIIa在体内自身免疫性血小板减少症中是一个重要的受体。

　　其他关于构建ITP小鼠模型的方法很多，包括通过干细胞移植使小鼠表达人类血小板抗原，如人类糖蛋白GPⅡb-Ⅲa等，但目前研究仍较少[24]。相信通过大鼠和小鼠模型来阐明ITP发病机制及治疗机理已经取得了实质性进展，通过实验对各方面因素进行合适的调整，有望建立一个理想的、稳定的、可操作性好的、能尽可能地模拟人体状态的动物模型，为研究ITP的发病机制和药物治疗机理提供可行性。

　　【参考文献】

　　1Iki S，Urabe A. Refractory idiopathic thrombocytopenic purpura. Nippon Rinsho. 2003，61: 609-614

　　2Cines DB，Bussel JB，McMillan RB，et al. Congenital and acquired thrombocytopenia. Hematology (Am Soc Hematol Educ Program). 2004: 390-406

　　3McKenzie SE，Reilly MP. Heparin-induced thrombocytopenia and other immune thrombocytopenias: lessons from mouse models. Semin Thromb Hemost，2004; 30: 559-568

　　4Harrington WJ，Minnich V，Hollingseorth JW，et al. Demonstration of a thrombocytopenic factor in the blood of patients with thrombocytopenic purpura. J Lab Clin Med，1951; 38:1-10

　　5Carpenter D，Yee T. Megakaryocytopenia in W/Wv mice is accompanied by an increase in size within ploidy groups and acceleration of maturation. Blood，1989; 74:94-98

　　6Ebbe S，Levin J，Miller K，et al. Thrombocytopoietic response to immunothrombocytopenia in nude mice. Blood，1987; 69:192-198

　　7Dominguez-Garcia MV，Rodriguez-Moyado H. Cellular and biochemical mechanisms involved in physiopathogenesis of autoimmune thrombocytopenic purpura. Gac Med Mex，2002; 138:461-472

　　8Teeling JL，Jansen-Hendriks T，Kuijpers TW，et al. Therapeutic efficacy of intravenous immunoglobulin preparations depends on the immunoglobulin G dimers: studies in experimental immune thrombocytopenia. Blood，2001; 98: 1095-1099

　　9Song S，Crow AR，Freedman J，et al. Monoclonal IgG can ame- liorate immune thrombocytopenia in a murine model of ITP: an alternative to IVIG. Blood，2003; 101: 3708-3713

　　10Hansen RJ，Balthasar JP. Pharmacokinetics，pharmacodynamics，and platelet binding of an anti-glycoprotein Ⅱb/Ⅲa Monoclonal Antibody (7E3) in the rat: a quantitative rat model of immune thrombocytopenic purpura. J Pharmacol Exp Ther，2001; 298:165-171

　　11Hansen RJ，Balthasar JP. Effects of intravenous immunoglobulin on platelet count and antiplatelet antibody disposition in a rat model of immune thrombocytopenia. Blood，2002; 100:2087-2093

　　12Mizutani H，Engelman RW，Kurata Y，et al. Development and characterization of monoclonal antiplatelet autoantibodies from autoimmune thrombocytopenic purpura-prone (NZW x BXSB)F1 mice. Blood，1993; 82: 837-844

　　13Musaji A，Vanhoorelbeke K，Deckmyn H，et al. New model of transient strain-dependent autoimmune thrombocytopenia in mice immunized with rat platelets. Exp Hematol，2004; 32: 87-94

　　14Crow AR，Lazarus AH. Role of Fcgamma receptors in the pathogenesis and treatment of idiopathic thrombocytopenic purpura. J Pediatr Hematol Oncol，2003; 25 (Suppl 1): S14-18

　　15Cooper N，Heddle NM，Haas M，et al. Intravenous (Ⅳ) anti-D and Ⅳ immunoglobulin achieve acute platelet increases by different mechanisms: modulation of cytokine and platelet responses to IV anti-D by FcgammaRⅡa and FcgammaRⅢa polymorphisms. Br J Haematol，2004; 124: 511-518

　　16Song S，Crow AR，Siragam V，et al. Monoclonal antibodies that mimic the action of anti-D in the amelioration of murine ITP act by a mechanism distinct from that of IVIg. Blood，2005; 105: 1546-1548

　　17Carcao MD，Blanchette VS，Wakefield CD，et al. Fcgamma receptor Ⅱa and Ⅲa polymorphisms in childhood immune thrombocytopenic purpura. Br J Haematol，2003; 120:135-141

　　18Crow AR，Song S，Semple JW，et al. IVIg inhibits reticuloendothelial system function and ameliorates murine passive-immune thrombocytopenia independent of anti-idiotype reactivity. Br J Haemato，2001; 115: 679-686

　　19Clynes R，Ravetch JV. Cytotoxic antibodies trigger inflammation through Fc receptors. Immunity，1995; 3: 21-26

　　20Crow AR，Song S，Freedman J，et al. IVIg-mediated amelioration of murine ITP via FcRⅡB is independent of SHIP1，SHP-1，and Btk activity. Blood，2003; 102: 558-560

　　21Karassa FB，Trikalinos TA，Ioannidis JP. The role of Fcgamma RⅡA and ⅢA polymorphisms in autoimmune diseases. Biomed Pharmacother，2004; 58: 286-291

　　22McKenzie SE，Taylor SM，Malladi P，et al. The role of the human Fc receptor/FcγRIIA in the immune clearance of platelets: a transgenic mouse model. J Immunol，1999; 162: 4311-4318

　　23McKenzie SE. Humanized mouse models of FcR clearance in immune platelet disorders. Blood Rev，2002; 16: 3-5

　　24Cines DB，McKenzie SE，Siegel DL. Mechanisms of action of therapeutics in idiopathic thrombocytopenic purpura. J Pediatr Hematol Oncol，2003; 25 (Suppl 1): S52-56