急性白血病M4Eo型患者ETV6基因重排及其意义

　　作者：高娜,李志红,丁卜同,陈昀,汪运山　　作者单位：. 山东大学附属济南市中心医院血液科， 济南 250013;2. 兖矿集团兴隆庄煤矿医院， 山东 兖州 272102;3. 山东大学附属济南市中心医院检验科， 济南 250013

　　【摘要】目的 探讨在急性髓细胞白血病(AML)M4Eo型患者中检测到ETV6基因重排的临床意义。方法 对3例AMLM4Eo患者骨髓标本进行细胞培养，制备染色体，分析核型，Splitsignal FISH技术分析12p13染色体易位，RTPCR检测ETV6/ARG融合基因产物。结果 核型分析显示3例患者均有inv(16)，Splitsignal FISH检出12p13染色体易位1例，RTPCR证实患者ETV6/ARG融合基因产物阳性。这是国际上第2例报道ETV6/ARG融合基因在AMLM4Eo中表达。结论 伴有ETV6/ARG融合基因的患者对化疗不敏感，预后较ETV6/ARG融合基因阴性者差。Splitsignal FISH是检测ETV6基因重排准确可靠的手段。

　　【关键词】 白血病,ETV6,原位杂交;聚合酶链反应

　　To explore the clinical significance of ETV6 gene rearrangement involved in acute myelogenous leukemia M4Eo. Methods 3 cases of AML M4Eo were prepared from chromosomes after bone marrow cell culture. Rbanding technique was used to analyze the karotypes. 12p13 translocation was determined by Splitsignal FISH in interphase and metaphase cells. ETV6/ARG fusion genes were analyzed by RTPCR. Results Clone chromosomal abnormalities with inv(16) were found by Karotype analysis in 3 cases, abnormal fluorescence signal with 12p13 translocation was found in 1 case by splitsignal FISH, and ETV6/ARG fusion gene was found by RTPCR. This was the second report that ETV6/ARG expressed in AML-M4Eo. Conclusions This patient is not sensitive to chemical therapy, and even has a worse prognosis than patients without this fusion gene. Splitsignal FISH is a reliable measure to detect ETV6 gene rearrangement.

　　Key words: Leukemia; ETV6; In situ hybridization; RTPCR

　　急性髓细胞白血病(acute myelogenous leukemia，AML)分多种类型，常伴有特异的染色体异常。急性髓细胞白血病M4Eo型是一类少见的伴有异常嗜酸性粒细胞增多的恶性克隆性造血系统疾病,inv(16)是其常见的染色体异常。ETV6基因在多种造血系统恶性疾病中均检测到,可与多种伙伴基因相融合,对疾病的发生、发展、预后有极其重要的意义[12]。为研究AMLM4Eo患者ETV6基因重排及意义,本研究应用Splitsignal FISH技术对3例确诊为AMLM4Eo的患者染色体标本进行检测分析，发现1例M4Eo患者存在12p13与1q25的易位,经RTPCR证实易位形成的融合基因为ETV6/ARG,这是继Cazzaniga.G等[3]4370在M4Eo病人中首次报道ETV6/ARG融合基因后发现的第2例该融合基因阳性的M4Eo病人。

　　1 资料与方法

　　1.1 病例资料

　　3例AMLM4Eo患者均为初治病例，临床诊断根据患者的临床表现、骨髓细胞形态学、骨髓细胞化学染色、免疫学、细胞遗传学和分子生物学检查结果并参照2001年WHO的分型和诊断标准来确定。

　　1.2 骨髓细胞培养及染色体制备方法

　　取患者骨髓标本,在无刺激条件下培养16～24?h后收获细胞,常规制备骨髓细胞染色体,进行R显带处理,核型根据《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN 1995)》识别和描述。

　　1.3 Splitsignal FISH分析

　　对3例AMLM4Eo患者染色体标本进行荧光原位杂交检测其ETV6重排情况。荧光原位杂交试剂盒、Human CotI DNA、链霉亲和素HRP工作液、DAPI均购自美国Invitrogen公司,缺口平移法标记探针DigNick Translation Mix试剂盒、BiotinNick Translation Mix试剂盒、抗DigAP、HNPP/Fast Red TR均为Roche公司产品,质粒DNA提取试剂盒为QIAGEN公司产品,去离子甲酰胺为AMRESCO公司产品,严格按操作说明书进行操作。

　　1.3.1 探针

　　选取位于ETV6基因两侧的基因序列(BAC)作为探针。选取的两个人工合成的细菌BAC序列均购自Invitrogen公司,将含BAC序列(RP11434C1和RP11525I3)的大肠杆菌进行扩增,用质粒DNA提取试剂盒提取目的DNA,即为探针DNA,分别用DigNick Translation Mix、BiotinNick Translation Mix标记，然后用Quick Spin Columns(Roche公司产品)纯化,最终得到纯化后的探针分别为DIG525I3和Bio407P10。探针变性液包括去离子甲酰胺、氯化钠/柠檬酸钠混合液(SSC液)、去离子水、浓盐酸。

　　1.3.2 步骤

　　染色体标本从-20?℃的冰箱中取出后,滴片,晾干,经2×SSC,脱水，RNase A, 蛋白酶K处理,72?℃玻片变性,探针在76?℃变性液中变性5?min，置冰上5?min后于37?℃预杂交1?h，将探针滴加在玻片上,石蜡封片,37?℃湿盒过夜(>16?h)。次日进行洗片,封闭，特异性免疫反应,染色,DAPI复染,指甲油封片，室温避光放置24?h后荧光显微镜下观察结果。

　　1.3.3 阳性细胞判断标准

　　细胞核中可观察到3种情况：① 2个红绿毗邻信号或者黄色荧光信号(由红色和绿色组合成的融合信号),提示ETV6基因未发生重排;② 1个红绿毗邻或黄色荧光信号和1红1绿分离存在的2个荧光信号，提示ETV6基因发生重排;③ 2红2绿分离存在的4个荧光信号，提示同源染色体上ETV6基因都发生重排。只要患者细胞中出现红绿荧光信号分离即为阳性。

　　1.4 逆转录聚合酶链反应

　　对涉及12p13和1q25易位的患者采用RTPCR检测ETV6/ARG融合基因。TRIzol试剂盒购自美国Invitrogen公司,逆转录PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。先从病人骨髓单个核细胞中提取RNA,然后反转录成cDNA。以ETV6 F1:5′ATCGGGAAGACCTGGCTTACA3′ F2:5′TGAAGAGCACGCCATGCCCATTG3′和ARG R1:5′TGCCTGGGGTTCAACATCAC3′R2:5′TACTGCCTCCAGTCTTGTCT3′为引物进行PCR扩增。扩增后取产物在琼脂糖凝胶中电泳,扫描并分析结果。

　　2 结 果

　　2.1 传统细胞遗传学分析

　　采用骨髓细胞染色体R显带核型分析3例AML-M4Eo患者均存在 inv(16)，传统核型分析未发现12p13和1q25畸变。

　　2.2 Splitsignal FISH 对3例AMLM4Eo患者染色体标本进行荧光原位杂交检测其ETV6重排情况，证实1例患者存在12p13，1q25的易位，核型为46 XY，inv(16)，t(1;12)(q25;p13)，荧光显微镜下可观察到患者细胞核中有红色和绿色荧光信号的分离(图1),提示12p同源染色体均发生断裂。该患者资料如下：夏某，男，13岁，因“发现颈部淋巴结肿大，发热，伴有面黄，乏力”入院治疗，血常规示白细胞明显增多，血小板减少，血涂片可见幼稚粒细胞和幼稚单核细胞。骨髓细胞形态学检查示骨髓增生明显活跃，原始粒细胞26.8%，嗜酸性粒细胞17.8%，体积较大，胞浆丰富，内有粗大的异常嗜酸颗粒，未见Auer小体。单核系统异常增加,原始单核细胞占18.2%,幼稚单核细胞占28%，确诊为“急性非淋巴细胞白血病(M4Eo)”。给予柔红霉素、阿糖胞苷(DA)方案化疗2个疗程,复查骨髓像达完全缓解(CR)，5个月后骨髓复发再次入院化疗，给予大剂量阿糖胞苷(HDAraC)方案化疗3个疗程后达CR，但4个月病人再次骨髓复发并中枢神经系统白血病(CNSL)入院,在治疗过程中多次出现耐药现象，病人放弃治疗,出院后失去随访。其余2例inv(16)M4Eo患者对大剂量阿糖胞苷敏感，缓解期明显长于此例,中位生存期超过18个月。

　　2.3 RTPCR 对涉及12p13和1q25易位的患者采用RTPCR检测到ETV6/ARG融合基因(图2)。

　　3 讨 论

　　ETV6基因(又称TEL基因)定位于12p13,全长300kb,由8个外显子构成,编码452个氨基酸,属ETS转录因子家族成员,由羧基端的EtsDNA结合域和氨基端的螺旋-环-螺旋结构域组成。该基因可与多种伙伴基因相融合,例如PDGFRB,ABL,JAK2,NTRK3等。ETV6是在急、慢性白血病,骨髓异常增生综合征和恶性淋巴瘤中均受累的所谓“杂合"基因,多种染色体易位均可导致ETV6基因重排,到目前为止报道的ETV6基因相关的染色体易位超过30种,不同的ETV6基因重排通过不同的机制参与白血病的发生。

　　inv(16)是M4Eo特征性的染色体重排,具有inv(16)的M4Eo型患者化疗后缓解率较高(78%),中位生存期较长(>66周),该亚型预后较好，对大剂量阿糖胞苷反应敏感，中枢神经系统白血病少见。本研究中，3例M4Eo患者均检出inv(16),常规核型分析未发现12p13和1q25染色体畸变，荧光原位杂交检测到12p13和1q25易位1例。进一步行RTPCR证实有ETV6/ARG融合基因产物的存在,这是国内首次在M4Eo患者中发现有ETV6/ARG融合基因的表达。该患者化疗后缓解期短，两次复发并发生中枢神经系统白血病,在治疗过程中对化疗不敏感，预后较其他2例该融合基因阴性者要差。

　　ARG基因(即ABL Related Gene)又称ABL2基因，位于1q25，是与cABL同属Abelson家族的非受体酪氨酸激酶，在TK、SH2和SH3结构域具有高度的同源性。迄今为止,关于ARG基因在细胞中的功能,以及在造血系统发生中的作用还知之甚少。ETV6/ARG融合基因的报道意味着首次在人类恶性肿瘤中发现有ARG基因的参与[4]。国外研究发现，12p断裂点位于ETV6基因外显子5附近，而ARG基因的断裂点有两个，分别位于第362碱基对，和第425碱基对处，因此在细胞中可检测到两种ETV6/ARG融合基因，不管哪一种融合基因均包括ETV6的HLH寡聚合结构域和ARG的SH2，SH3结构域以及完整的酪氨酸蛋白激酶(PTK)活性域[3]4372。国外亦有报道，在AMLM3白血病细胞株(HT93A)[5]以及成熟TALL细胞株[6]中检测到ETV6/ARG融合基因。ETV6/ARG致白血病的作用可能与ETV6/ABL一样，是ETV6的HLH结构域为ARG激酶结构域提供了二聚化界面[7]，从而激活了ARG,通过信号传导途径作用于相邻的转录因子和靶基因，造成细胞的恶性转化。当然,对于ETV6/ARG融合基因的致癌机制还需要进一步的研究证实。

　　本研究中，应用Splitsignal FISH检测到ETV6基因重排,而常规细胞遗传学只检测到inv(16),未发现12p13和1q25畸变，说明常规细胞遗传学分析常有一些染色体易位不易发现或有不明来源的标志染色体或有复杂的染色体易位不易诊断。Splitsignal FISH则可解决这些难题，在一些特殊染色体异常检测中,有助于精确的诊断和预后评估。

　　综上所述，本研究在M4Eo患者中检测到ETV6基因重排提示预后不良。Splitsignal FISH是检测ETV6基因重排的有效手段，此次在M4Eo患者中检测到12p13和1q25畸变，并有ETV6/ARG融合基因产物阳性，此染色体异常是否为M4Eo患者特异性染色体改变，在其他类型白血病和血液系统肿瘤中是否也存在，以及其对于血液病的诊断，治疗和预后的意义尚需进一步的研究。

　　【参考文献】

　　[1]丁卜同，郭农建，孙建芝，等.骨髓增生异常综合征患者ETV6基因重排分析及其临床意义[J].中华血液学杂志，2007，28(12)：804807.

　　[2]冯国安，郭农建.ETV6NTRK3融合基因与肿瘤相关性研究[J].国外医学肿瘤学分册，2004，31(9)：665666.

　　[3]Cazzaniga G, Tosi S, Aloisi A, et al. The tyrosine kinase Ablrelated gene ARG is fused to ETV6 in an AMLM4Eo patient with a t(1;12)(q25;p13):Molecular colning of both reciprocal transcripts[J]. Blood, 1999, 94(12):43704373.

　　[4]Iijima Y, Okuda K, Tojo A. Transformation of Ba/F3 cells and Rat1 cells by ETV6/ARG[J]. Oncogene, 2002, 21(3):43744383.

　　[5]Iijima Y, Ito T, Oikawa T, et al. A new ETV6/TEL partner gene,ARG(ABLrelated gene or ABL2), identified in an AMLM3 cell line with a t(1;12)(q25;p13)translocation[J]. Blood, 2000, 95(6):21262131.

　　[6]Griesinger F, Janke A, Podleschny M, et al. Identification of an ETV6ABL2 fusion transcript in combination with an ETV6 point mutation in a Tcell acute lymphoblastic leukaemia cell line[J]. Br J Haematol, 2002, 119(17):454458.

　　[7]Maki K, Arai H, Waga K, et al. Leukemiarelated transcription factor TEL is negatively regulated through extracellular signalregulated kinaseinduced phosphorylation[J]. Molecular Cellular Biology, 2004, 24(8):32273237.