亚硒酸钠对K562/ADR细胞系VEGF表达的影响

　　作者：崔晶,吴轶萍,丁璟,刘复强　　作者单位：首都医科大学附属北京同仁医院血液科， 北京 100730

　　【摘要】为了探讨亚硒酸钠对K562/ADR细胞VEGF表达的影响， 分别以5、10 μmol/L的亚硒酸钠对培养的K562及K562/ADR细胞进行处理，应用ELISA法检测亚硒酸钠处理前和处理后不同时间的K562及K562/ADR细胞上清液中VEGF含量，用MTT法检测逆转耐药倍数。 结果表明： 亚硒酸钠可以增加K562/ADR细胞对阿霉素的敏感性，其逆转耐药的倍数为3.48倍; 两种细胞系分泌的VEGF含量随培养时间的延长增加，并且各个时间段的K562/ADR细胞VEGF表达均高于K562细胞(P<0.05); 5、10 μmol/L的亚硒酸钠在72小时内均不能抑制K562细胞VEGF的分泌(P>0.05);而作用96小时时K562细胞上清液中VEGF水平虽有下降，但未达统计学意义; 5、10 μmol/L的亚硒酸钠在48小时内均不能抑制K562/ADR细胞VEGF的分泌(P>0.05)，10 μmol/L的亚硒酸钠在作用72和96小时可以明显抑制VEGF的分泌(P<0.001)，5 μmol/L的亚硒酸钠在作用96小时可以抑制VEGF的分泌(P<0.001)。 结论： VEGF可能与白血病多药耐药有关，而亚硒酸钠则能抑制白血病细胞分泌VEGF。

　　【关键词】 亚硒酸钠,白血病,血管内皮生长因子 K562细胞 ADR细胞; 耐药

　　Abstract In order to investigate the effects of Na2SeO3 on expression of VEGF in K562/ADR cells, K562 and K562/ADR cells were treated with Na2SeO3 at dose of 5 and 10 μmol/L. The expressions of VEGF in K562 and K562/ADR cells were detected by ELISA before and at the different time point after treatment. The mutiplie of reversion of resistance was detected by MTT method. The results showed that Na2SeO3 at dose of 10 μmol/L could increase the sensitivity of K562/ADR cell to adriamycin, the multiple of reversion was 3.48. The expression levels of VEGF in K562 and K562/ADR cells increased with prolongation of time cultured, and the VEGF expression levels in K562/ADR cells at the different time points were higher than that in K562 cells (P<0.05); 5 and 10 μmol/L Na2SeO3 did not suppress expression of VEGF in K562 cells at 72 hours (P>0.05), and the VEGF level in K562 cells at 96 hours decreased without statistical significance; 5 and 10 μmol/L Na2SeO3 acting for 48 hours did not show suppressive effect on expression of VEGF in K562/ADR cells (P>0.05), 5 μmol/L Na2SeO3 could decrease the expression of VEGF in K562/ADR cell after treatment for 96 hours, while 10 μmol/L Na2SeO3 could significantly decrease the expression of VEGF in K562/ADR cells treated for 72 hours and 96 hours (P<0.01). It is concluded that VEGF would be involved in the multidrug resistance of leukemia. Na2SeO3 decreasing expression of VEGF in leukemic cells may be one of the mechanisms reversing multidrug resistance.

　　Key words Na2SeO3; Leukemia; VEGF; K562 cell; ADR cell; drug resistance

　　硒是人体必需的一种微量元素。近年来发现，硒在血液系统肿瘤的发生和治疗中都有重要的作用。硒可以通过抑制白血病细胞生长、促进其凋亡，使细胞DNA合成下降，达到抗血液肿瘤的效应。亚硒酸钠对耐药的白血病亦有诱导凋亡作用。因此，将硒这种人体必需的微量元素作为血液病的辅助治疗越来越受到关注。白血病细胞对化疗药物的耐受性是白血病治疗的主要障碍，是化疗后复发的主要原因，也是白血病化疗改善缓慢的主要原因。我们前期的实验证实了亚硒酸钠可以部分逆转K562/ADR细胞的耐药性，在本研究中我们对敏感及耐药K562细胞系进行血管内皮生长因子(VEGF)水平的观察，从VEGF水平探讨硒对K562/ADR细胞系可能的耐药逆转机制。

　　材料和方法

　　肿瘤细胞株

　　人急性红白血病细胞株K562和耐阿霉素的K562细胞株K562/ADR购自中国医学科学院天津血液研究所。分别将两种细胞株设立为A、B、C 3组，其中A组为对照组(不加药)，B组加亚硒酸钠5 μmol/L，C组加亚硒酸钠10 μmol/L。K562细胞为A1、B1、C1; K562/ADR细胞为A2、B2、C2。

　　中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(3)亚硒酸钠对K562/ADR细胞系VEGF表达的影响主要试剂

　　亚硒酸钠(Na2SeO3)、溴化四氮唑(MTT)及二甲基亚砜(DMSO)为Sigma公司产品。RPMI 1640培养液及胎牛血清(FBS)购自中国医学科学院细胞中心。VEGFELISA试剂盒为Cytimmune公司产品。

　　细胞培养

　　将K562细胞及K562/ADR细胞置于含20%胎牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100 U/ml的RPMI 1640培养液中，放在37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，取对数生长期的细胞进行实验。K562/ADR细胞于实验前2周脱药。

　　耐药逆转的MTT法检测

　　取对数生长期的K562细胞及K562/ADR细胞，以1×105/ml的密度接种于96孔板，每孔加细胞悬液100 μl，加入不同浓度阿霉素(ADR)，每个药物浓度设平行3孔，置37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养72小时，加20 μl MTT溶液，在37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中继续培养4小时，加二甲亚砜(DMSO)溶液150 μl，在微型混合器上震荡15分钟，置酶标仪570 nm处测吸光度值，计算细胞增殖抑制率、IC50。

　　细胞存活率=(加药OD值/对照OD值)×100%

　　细胞增殖抑制率 =[1-(加药OD值/对照OD值)]×100%

　　IC50为细胞增殖抑制50 %时的药物浓度; IC50用线性回归法处理。并由此得出各自IC50。

　　细胞培养上清液中VEGF含量的ELISA法检测

　　取对数生长期的细胞，以1×105/ml的密度接种于24孔板，每孔加入细胞悬液500 μl，即50 000个细胞，加入一定浓度(0、5、10 μmol/L)的药物及1640培养液至每孔总体积达到1 000 μl，每一浓度设平行3孔，置37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。间隔24小时收集细胞，收集24、48、72、96小时细胞， 90×g离心5分钟后吸取细胞上清液，置-20℃冻存。测定样本VEGF时，先将冻存样本置于室温使之融化，然后按照VEGF ELISA试剂盒操作步骤依次加样、孵育、洗涤、酶标仪比色。

　　统计学方法

　　所有数据均以均数±标准差(±SD)表示。P<0.05表示有显著性差异，P<0.01表示有非常显著性差异。采用SPSS 11.0软件分析数据，行独立t检验。

　　结 果

　　亚硒酸钠对K562/ADR细胞对阿霉素耐药性的影响

　　阿霉素对K562细胞和K562/ADR细胞的IC50分别为：0.049±0.002 μg/ml和8.28±1.27 μg/ml，即K562/ADR细胞的耐药性是K562细胞的169倍。5 μmol/L亚硒酸钠作用48和 72小时均不增加K562/ADR细胞对阿霉素的敏感性，耐药逆转倍数分别为1.03和1.05;10 μmol/L亚硒酸钠作用48小时对K562/ADR细胞对阿霉素的敏感性也无影响，作用72小时时可以增强K562/ADR细胞对阿霉素的敏感性，耐药逆转倍数为3.48倍。这些结果提示亚硒酸钠对A562/ADR的逆转耐药作用呈浓度和时间依赖性。

　　VEGF在急性红白血病细胞系K562及其耐药细胞系K562/ADR表达的比较

　　比较敏感细胞系和耐药细胞系在不同培养时间(24、48、72、96小时)时上清液VEGF水平的结果表明：随着培养时间的延长，两种细胞系所分泌的VEGF均逐渐增加，并且各个时间点的耐药细胞系VEGF表达均高于敏感细胞系(P<0.05)。

　　亚硒酸钠对K562及K562/ADR细胞VEGF表达的影响

　　5、10 μmol/L的亚硒酸钠在72小时内均不能抑制K562细胞上清液中VEGF的分泌(P>0.05)。在作用96小时时，K562细胞上清液中VEGF水平均有下降，但未达统计学意义。

　　5、10 μmol/L的亚硒酸钠在24、48小时均不能抑制K562/ADR细胞VEGF的分泌(P>0.05)，10 μmol/L的亚硒酸钠在作用72、96小时可以明显抑制VEGF的分泌(P<0.001)，5 μmol/L的亚硒酸钠在作用96小时可以抑制VEGF的分泌(P<0.001)。这提示亚硒酸钠对K562/ADR细胞VEGF的分泌存在时间和数量的依赖关系。

　　讨 论

　　近年来发现，在多种血液病患者骨髓中有VEGF的过度表达[1-4]，因而考虑VEGF可能在血液病的发病中担任了重要的角色。但是，在急性髓性白血病中，不同FAB分类所表达的VEGF水平是不同的[5]，并不是所有均为升高，这可能与VEGF的自分泌、旁分泌途径及骨髓内环境的影响有关。本实验以急性红白血病细胞系K562及其耐药细胞系K562/ADR为研究对象，应用ELISA方法检测两种细胞系培养上清液中VEGF的含量。结果表明：两种细胞系均有VEGF的表达，并且发现耐药细胞系K562/ADR中VEGF的表达高于K562细胞。这些结果说明：敏感及耐药的白血病细胞K562均具有产生VEGF的能力;由于耐药细胞系产生的VEGF高于敏感细胞系，推测VEGF可能与白血病细胞的耐药有关。这与我们的前期实验[6]及一些学者[7，8]的临床研究结果是相符的。VEGF可能与血液病预后有关，VEGF表达水平越高，预后越差。郭宗明[9]观察了36例化疗后急性白血病患者血浆VEGF含量，同时检测其骨髓单个核细胞Pgp的表达，发现难治、复发急性白血病患者血浆VEGF含量较对照者和完全缓解者明显升高，VEGF含量与Pgp表达具有一定的相关性，而完全缓解者VEGF含量与正常对照者之间无显著性差异，提示VEGF可能参与急性白血病MDR的发生。Zhu等[10]发现VEGF在难治性白血病中表达高，且过度表达的VEGF降低了化疗药(三尖杉酯碱)诱导的白血病细胞的凋亡，故认为VEGF在难治性白血病的发病机理中也有很重要的作用。Katoh等[11]报道VEGF可以抑制电离辐射诱导的骨髓造血干细胞凋亡，并且经VEGF处理过的白血病细胞系CMK86能抵抗VP16、阿霉素的诱导凋亡作用，VEGF是通过诱导抗凋亡基因MCL1表达而增强白血病细胞抵抗凋亡的能力。Dias等[12]发现VEGFR表达阳性的白血病细胞，VEGF可通过与其受体KDR相互作用导致热休克蛋白90(HSP90)升高，引起一系列连锁反应，最后引起Bcl2表达增加，由此提示了血液肿瘤细胞的VEGF自分泌途径可能参与了其耐药性的产生。最近发现：化疗药物，如全反式维甲酸、柔红霉素等，不但可以通过诱导白血病细胞凋亡和抑制其生长达到治疗目的，而且还可以通过抑制VEGF表达起到抗白血病的效应，并且这种抑制作用呈时间、剂量依赖[13]。

　　本研究发现： 5 μmol/L、10 μmol/L的亚硒酸钠在作用72小时内对敏感的白血病细胞系K562的VEGF的表达没有影响，作用96小时， VEGF水平有所下降，但是未达统计学意义。不同浓度的亚硒酸钠在作用48小时内不能抑制耐药细胞系K562/ADR的VEGF的分泌，而5 μmol/L的亚硒酸钠在作用96小时、10 μmol/L的亚硒酸钠在作用72、96小时可以抑制VEGF的分泌[14]。这与我们在亚硒酸钠对耐药细胞系K562/ADR的耐药逆转实验中的结果是相吻合的，亚硒酸钠在作用72小时可以部分逆转K562/ADR细胞的耐药性，而48小时却没有此作用，这说明亚硒酸钠可以抑制耐药细胞系VEGF的表达，并且这种作用需要一定的时间(即72小时后)和剂量才能达到。大量研究结果提示，细胞凋亡途径不能被激活可能就是白血病细胞耐药的本质。Le Gouill等[15]研究发现，VEGF抑制剂GW654652可以抑制VEGF诱导的Mcl1上调，使得增殖减少和诱导凋亡。还有些学者[16]利用基因转染技术，将VEGF(121)cDNA sense(S) 载体和抗cDNA sense载体(AS)转染到K562细胞，结果与对照组比，K562/AS中VEGF分泌减少了49%，而K562/S中VEGF分泌则提高3倍。K562/AS在体外表现为生长延迟。将其植入裸鼠体内，用抗cDNA sense植入的表现为肿瘤MVD下降，与α干扰素共同作用使凋亡增加。这说明单独应用抗VEGF或联合传统化疗治疗可能是有效的。

　　近年来研究认为，血液肿瘤自分泌VEGF可能与血液病的发生和耐药相关，故抑制VEGF的分泌是一个治疗的靶点。我们的前期实验证实亚硒酸钠不能抑制HL60细胞VEGF的分泌，但是可以通过抑制VEGFR达到抑制HL60细胞的生长[17]，本实验也证实亚硒酸钠不能抑制K562细胞VEGF的分泌,这说明对于敏感的白血病细胞，亚硒酸钠作用途径不是通过VEGF。从亚硒酸钠可以逆转白血病细胞耐药及抑制耐药的白血病细胞分泌VEGF结果我们可以推断：抑制细胞分泌VEGF而达到抑制耐药细胞的血管新生可能是逆转K562/ADR耐药的作用途径之一，关于其机制还有待于进一步阐明。

　　【参考文献】

　　1Wang Y, Xiao ZJ, Liu P. Expression of angiogenic factors and their clinical significances in acute myeloid leukemia. 癌症， 2004; 23(Suppl 1):1423-1427

　　2Krauth MT, Simonitsch I, Aichberger KJ, et al. Immunohistochemical detection of VEGF in the bone marrow of patients with chronic myeloid leukemia and correlation with the phase of disease. Am J Clin Pathol, 2004; 121:473-481

　　3UsnarskaZubkiewicz L, Mazur G, Wrobel T, et al. Expression of serum vascular endothelial growth factor correlates with clinical outcome in multiple myeloma. Pol Arch Med Wewn, 2003; 110:719-724

　　4Norgaard JM， Hokland P. Biology of multiple drug resistance in acute leukemia. Int J Hematol, 2000; 2:290-297

　　5Ghannadan M, Wimazal F. Simonitsch I, et al. Immunohistochemical detection of VEGF in the bone marrow of patients with acute myeloid leukemia. Correlation between VEGF expression and the FAB category. Am J Clin Pathol, 2003; 119:663-671

　　6叶进，刘复强，吴轶苹. VEGF及其受体在恶性血液细胞系HL60及Raji的表达. 中国实验血液学杂志,　2003; 11:376-380

　　7Aguayo A, Kantarjian HM, Estey EH, et al. Plasma vascular endothelial growth factor levels have prognostic significance in patients with acute myeloid leukemia but not in patients with myelodysplastic syndromes. Cancer, 2002; 95:1923-1930

　　8deBont ES, Fidler V, Meeuwsen T, et al. Vascular endothelial growth factor secretion is an independent prognostic factor for relapsefree survival in pediatric acute myeloid leukemia patients. Clin Cancer Res, 2002; 8:2856-2861

　　9郭宗明，谢兆霞，秦忆. 急性白血病患者VEGF与多药耐药关系的初步探讨. 中国现代医学杂志, 2004;5：121-123

　　10Zhu Z, Hattori K, Zhang H, et al. Inhibition of human leukemia in an animal model with human antibodies directed against vascular endothelial growth factor receptor 2. Correlation between antibody affinity and biological activity. Leukemia, 2003;17:604-611

　　11Katoh O，Takahashi T，Oguri T， et al. Vascular endothelial growth factor inhibits apoptotic death in hematopoietic cells after exposure to chemotherapeutic drugs by inducing MCL1 acting as an antiapoptotic factor. Cancer Res, 1998;58:5565-5569

　　12Dias S, Shmelkov SV, Lam G, et al. VEGF(165) promotes survival of leukemic cells by Hsp90mediated induction of Bcl2 expression and apoptosis inhibition. Blood, 2002; 99:2532-2540

　　13王晨，陈芳源，顾春红等. 全反式维甲酸和柔红霉素对NB4和HL60细胞株VEGF表达及分泌的影响. 中华血液学杂志，2004; 25：171-174

　　14He R, Liu B, Yang C, et al. Inhibition of K562 leukemia angiogenesis and growth by expression of antisense vascular endothelial growth factor (VEGF) sequence. Cancer Gene Ther, 2003; 10:879-886

　　15LeGouill S, Podar K, Amiot M, et al. VEGF induces Mcl1 upregulation and protects multiple myeloma cells against apoptosis. Blood, 2004; 104:2886-2892

　　16Ruan GR, Liu YR, Chen SS, et al. Effect of antisense VEGF cDNA transfection on the growth of chronic myeloid leukemia K562 cells in vitro and in nude mice. Leuk Res, 2004; 28: 763-769

　　17叶进,刘复强,吴轶苹. 全反式维甲酸和亚硒酸钠对HL60细胞VEGF及其受体表达的影响. 中国实验血液学杂志，　2004; 12:142-146