丙戊酸钠抑制HL-60细胞增殖并诱导其凋亡与分化

　　作者：韩冬梅,陈协群,梁蓉,董宝侠,尹文　　作者单位：第四军医大学西京医院血液内科，1第四军医大学微生物教研室，西安 710032

　　【摘要】为进一步研究丙戊酸钠(sodium valproate;VPA)对白血病细胞HL-60的增殖、凋亡和分化的影响，采用MTT法检测不同浓度的VPA对HL-60细胞增殖的作用;细胞化学染色法观察药物作用后细胞形态的变化;NBT还原实验结合形态学作为观测细胞分化指标;应用流式细胞术检测不同浓度药物作用后细胞周期的变化及凋亡细胞的比例。结果显示：VPA能明显抑制HL-60的增殖;经2 mmol/L VPA处理24-48小时后，HL-60出现胞浆空泡、核固缩、核碎裂及凋亡小体;Annexin V阳性的早期凋亡细胞比例由2.9%升高到17.1%;流式细胞术检测出明显的亚二倍体峰;G1期细胞由51.1%增加至84.6%，S期细胞由37.9%减低至14.4%。0.25 mmol/L VPA作用1周后，促进HL-60细胞向中幼粒、晚幼粒阶段分化，NBT阳性细胞百分率为(47±2)%。结论：VPA能明显抑制白血病细胞HL-60的增殖，并诱导其分化及凋亡。

　　【关键词】 丙戊酸钠

　　Abstract To investigate the influence of sodium valproate (VPA) on proliferation，apoptosis and differentiation of HL-60 cell line，effect of VPA in various concentrations on proliferation of HL-60 cells was detected by MMT;Wright-Giemsa staining was performed to observe the morphologic changes of HL-60 cells;NBT experiment was used to test the differentiation of HL-60 cells;flow cytometry was used to observe cell cycles and analyze the apoptosis. The results indicated that the changes of the growth curve showed inhibition of proliferation of HL-60 cells. After a 24-48 hours culture with 2 mmol/L VPA，the cells exhibited nuclear shrinkage，pyknosis fragmentation and appearence of apoptosis bodies. The percentage of the annexin V+/PI- cells which were apoptotic increased from 2.9% to 17.1%;hypodiploid peak was observed;the percentage of HL-60 cells in G1 phase increased from 51.1% to 84.6% and the cells in S phase decreased from 37.9% to 14.4%. After a week culture with 0.25 mmol/L VPA，the cells exhibited characteristics of differentiation. The percentage of NBT positive cells was (47±2)%. It is concluded that VPA can inhibit the proliferation of HL-60 cells while inducing differentiation and apoptosis of these cells. The mechanism needs to be further studied.

　　Key words sodium valproate;HL-60 cell;cell proliferation;cell apoptosis;cell differentiation

　　组蛋白脱乙酰基酶(histone deacetylase，HDAC)抑制剂在体外对于多种肿瘤细胞系有抑制细胞增殖、诱导凋亡及分化的作用。HDAC抑制剂对肿瘤细胞有选择性细胞毒性，而对正常造血细胞无严重毒性，且与多种现有化疗药物有协同作用[1]，在最近HDAC抑制剂已经开始I /II期临床试验。丙戊酸钠 (sodium valproate，VPA)是治疗癫痫的一种传统药物，毒副作用较小。最近发现，其在药理学水平有着HDAC抑制剂的特征性作用，可诱导肿瘤细胞分化与凋亡[2]。本试验以急性髓性白血病细胞HL-60为靶细胞，进一步探讨VPA对白血病细胞增殖、凋亡和分化的影响。

　　材料和方法

　　试剂

　　VPA由连云港制药厂生产，西京医院药剂科惠赠，纯度99.4%，分子式为C8H15NaO2，以去离子水配制成0.4 mol/L浓度，过滤分装，贮存于-20℃。小牛血清购自民海生物工程有限公司。四氮唑蓝(MTT)、佛波酯(TPA)为Sigma公司产品。硝基蓝四氮唑(NBT)为华美生物工程公司产品。

　　实验方法

　　细胞培养

　　急性髓性白血病细胞系HL-60来源于ATCC，由第四军医大学病理学教研室惠赠。细胞培养于含10%灭活小牛血清的RPMI 1640培养液(含青霉素、链霉素各0.1 U/L)中，置5% CO2饱和湿度、37℃培养箱中悬浮培养，2-3天换液1次，实验用细胞处于对数生长期。

　　MTT比色试验

　　取对数生长期HL-60细胞接种于96孔板，每孔接种1 500个细胞。根据预实验设VPA浓度为4、2、1和0.5 mmol/L，在相同实验条件下，处理组中细胞分别加入不同浓度的VPA。每个浓度设4个平行孔，分别于加药后2、3、4、5、6天检测，于每次检测前4 小时每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl;37℃继续孵育4小时，然后终止培养，离心、弃上清，每孔加入150 μl DMSO，充分溶解结晶物;而后选择492 nm波长在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。试验重复3次，取平均值。以时间为横坐标，光吸收值(OD)为纵坐标，绘制生长曲线

　　细胞形态学检查

　　2 mmol/L VPA处理HL-60细胞2天，0.25 mmol/L VPA处理HL-60细胞1周后，分别收集细胞悬液，离心，PBS液洗涤，甩片，常规Wright-Giemsa染色，光镜下观察细胞形态。

　　NBT还原能力测定

　　HL-60细胞在分化诱导剂的作用下能成熟分化。分化细胞中的过氧化物酶能使外源性的NBT还原成难溶性的紫色结晶物，并沉着于细胞内有酶活性的部位，显微镜下可见阳性细胞有着色斑，未分化细胞则呈NBT反应阳性。本试验以0.25 mmol/L VPA处理HL-60细胞，37℃ 5% CO2培养箱继续孵育，2-3天换液加药1次;1周后收集细胞，每管加入0.1% NBT溶液0.5 ml和TPA 200 ng，37℃孵育1小时;取细胞悬液甩片，Wright-Giemsa染色后计数200个活细胞，胞质中蓝紫色沉淀者为NBT反应阳性细胞，计数阳性细胞百分数，试验重复3次，取平均值。

　　流式细胞术 Annexin V是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸高亲和力特异性结合。碘化丙锭(PI)是一种核酸染料，将Annexin-V与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。正常细胞Annexin-V(-)PI(-)，早期凋亡细胞Annexin-V(+)PI(-)，晚期凋亡细胞和坏死细胞 Annexin-V(+)PI(+)。本试验用2 mmol/L VPA处理HL-60细胞24小时，取细胞悬液各1 ml(1×106个细胞)，PBS洗2次，离心弃上清，Annexin-V、PI避光染色20分钟，用ELITE ESP流式细胞仪(FCM Coulter公司)检测凋亡百分比;2 mmol/L VPA处理HL-60细胞48小时，收集细胞(2×106个细胞)，预冷PBS洗2遍，离心弃上清后加入1 ml PBS、2 ml无水乙醇4℃固定过夜，加入DNA-Prepstain染液后，同一仪器检测各组细胞的荧光强度，每份样品检测约5 000细胞，用DNA multi cycle软件(Beckman Coulter)进行统计学分析，得到各组细胞周期时相。试验重复3次，取平均值。

　　统计学分析

　　应用SPSS 10.0处理数据，组间率的比较采用Yates连续校正卡方检验，α=0.05。

　　结 果

　　VPA对HL-60细胞生长曲线的影响

　　实验显示4、2、1和0.5 mmol/L VPA对HL-60细胞均有不同程度的增殖抑制作用(图1)。

　　VPA对HL-60细胞分化的影响

　　0.25 mmol/L VPA作用1周后，出现核染色质浓缩，核仁消失，HL-60细胞向中幼粒细胞、晚幼粒细胞分化，偶见杆状核和分叶核(图2)。经0.25 mmol/L VPA作用1周后，实验组NBT阳性率为47%±2%，对照组为21%±6%，两组间有显著性差异(P<0.001)。

　　VPA对HL-60细胞凋亡的影响

　　2 mmol/L VPA作用48小时后，光学显微镜下观察可见：胞浆中大量空泡样改变，出现核固缩、核碎裂及凋亡小体(图3)。

　　VPA for 24 hoursVPA对HL-60细胞周期的影响

　　经2 mmol/L VPA处理48小时后，G1期细胞由51.1%增加至84.6%，S期细胞由37.9%减低至14.4%(P<0.001)，且出现明显的亚二倍体峰，凋亡细胞占32.6%(图5)。

　　讨 论

　　近年来研究发现，HDAC抑制染色质结构异常调节所致的髓系分化相关基因表达，是急性髓系白血病发病的重要因素之一。已有多种HDAC抑制剂已经进入I期或II期临床试验，在治疗血液系统恶性肿瘤和实体瘤方面都有令人鼓舞的相关报道[3-5]。VPA一直以来用于癫痫的治疗，毒副作用较小。它是短链脂肪酸的一种，也属于HDAC抑制剂。目前，国外有研究发现VPA通过半胱天冬酶依赖和非依赖两种途径导致白血病细胞凋亡[6]，而对正常造血细胞没有严重毒性，有可能用于抗肿瘤治疗;同时VPA对P-gp和(或)MRP1阳性的急性髓系白血病细胞同样存在抑制增殖和促凋亡作用[1]，所以VPA可能会对多药耐药细胞也有作用。另外，Kuendgen 等[7]单用VPA治疗19例MDS和继发于MDS的AML，其中有8例显效。所以VPA是一个具有应用前景的药物。但是，VPA用于白血病治疗的临床试验还未见报道，而且VPA治疗白血病的作用机制及其临床疗效尚待进一步研究。

　　为了进一步明确VPA的抗白血病作用，为VPA应用于临床治疗白血病提供有力的证据，我们以HL-60细胞为靶细胞，观察VPA对HL-60细胞增殖的影响和诱导凋亡、分化作用，MTT法证实VPA对HL-60细胞具有增殖抑制作用，2 mmol/L VPA作用于细胞，48小时后G1期细胞表达增加，G2、S期减少，有效抑制白血病细胞HL-60增殖。形态学检查、亚二陪体峰的出现以及流式细胞仪对凋亡细胞的分析均证明VPA可以促进HL-60细胞发生凋亡。0.25 mmol/L VPA作用于HL-60细胞1周后，NBT还原试验阳性，形态学检查说明细胞向成熟方向分化。本研究证实了小剂量VPA对白血病细胞有增殖抑制和诱导分化作用，而常规治疗癫痫剂量显示有促凋亡作用。因而，VPA有可能成为一种高效低毒的抗白血病药物。

　　【参考文献】

　　1Tang R，Faussat AM，Majdak P，et al. Valproic acid inhibits proliferation and induces apoptosis in acute myeloid leukemia cells expressing P-gp and MRP1. Leukemia，2004;18: 1246-1251

　　2Gottlicher M. Valproic Acid: an old drug newly discovered as inhibitor of histone deacetylases. Ann Hematol，2004;83(Suppl 2):S91-92

　　3Marks P，Rifkind RA，Richon VM，et al. Histone deacetylases and cancer: causes and therapies. Nat Rev Cancer，2001;1:194-202

　　4Johnstone RW. Histone-deacetylase inhibitors: novel drugs for the treatment of cancer. Nat Rev Drug Discov，2002;1: 287-299

　　5Cinatl J Jr，Cinatl J，Driever PH，et al. Sodium valproate inhibits in vivo growth of human neuroblastoma cells. Anti Cancer Drugs，1997;8: 958-963

　　6Kawagoe R，Kawagoe H，Sano K. Valproic acid induces apoptosis in human leukemia cells by stimulating both caspase-dependent and -independent apoptotic signaling pathways. Leuk Res，2002;26: 495-502

　　7Kuendgen A，Strupp C，Aivado M，et al. Treatment of myelodysplastic syndromes with valproic acid alone or in combination with all-trans retinoic acid. Blood，2004;104: 1266-1269