急性早幼粒细胞白血病免疫表型分析

　　作者：杨芝红,白永泽,赵颖,王贵杰　　作者单位：宁夏医科大学附属医院医学实验中心, 银川 750004

　　【摘要】 目的 探讨急性早幼粒细胞白血病细胞抗原表达的情况。方法 采用三色荧光标记流式细胞仪检测33例FAB分型为AML-M3患者的骨髓。结果 AML-M3患者CD45/SSC双参数散点图有其独特性，通常只可见两群细胞，其中正常淋巴细胞群比例减少，而幼稚细胞群所占比例增高且其SSC值较高，本研究中平均达90%以上。33例M3全部表达CD13、CD33，阳性率为100%，33例中2例分别表达CD34和HLA-DR，其表达阳性率各为3.0%，CD117表达百分比为63.6 %，支持CD117在APL患者原始细胞表达较高水平的观点。结论 三色荧光标记流式细胞术，CD45/SSC设门方法可将幼稚细胞与正常细胞区分开来，可特异地对幼稚细胞进行分析，极大地提高了APL免疫学分型的诊断准确率。

　　【关键词】 急性早幼粒细胞白血病,免疫表型,流式细胞术

　　急性白血病(Acute Leukemia ，AL)是造血系统的一种恶性疾病。近年来随着单克隆抗体的不断开发及流式细胞术的广泛开展, 急性白血病免疫表型研究得到迅猛发展, 并极大地提高了白血病诊断和分型的准确性。急性早幼粒细胞白血病(APL)的生物学特征在AL中较独特，其免疫表型也较具特色。为了探讨APL的生物学特征及其表型特征，本研究采用三色流式细胞术CD45/SSC双参数散点图设门方法对APL患者进行免疫表型分析，以了解APL细胞抗原表达的情况。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　所有病例均为我院2006年1月-2009年5月血液内科与儿科收治的APL初诊住院患者，33例中男14例，女19例，年龄6～68岁，平均37岁。33例中肝肿大25/33例，脾肿大30/33例，淋巴结肿大25/33例，发热30/33例，33例均有不同程度的出血。血象检查：三系减少31例，白细胞总数轻度增高(HGB、PLT减少)2例。血涂片白细胞分类25例以淋巴细胞为主，未见白血病细胞，8例可见30%～70%早幼粒细胞。骨髓象特征：骨髓有核细胞增生极度活跃6例，增生明显活跃24例，增生活跃3例，分类早幼粒细胞比值占52%～96%，平均80%，此类细胞多含有粗大或细小的大小不等的嗜天青颗粒，其中20例可见到Auer小体。所有患者骨髓及外周血涂片经瑞氏染色后分类计数，按FAB分型标准进行形态学分型。细胞组化染色包括髓过氧化酶(POX)染色、特异性酯酶(AS-D)染色、非特异性酯酶(NAE)及氟化钠抑制试验。

　　1.2 仪器与试剂 为美国BD公司的FACSCaliber流式细胞仪，所有荧光单克隆抗体(McAb)及相关试剂均为BD公司产品，所用荧光包括FITC(异硫氰酸荧光素)、PE(藻红蛋白荧光素)和Per CP(叶绿素蛋白)，单抗选择，髓细胞系：CD13、CD33 、CD14、CD15、CD117;T淋巴细胞系：CD3、CD5、CD7;B淋巴细胞系：CD10、CD19、CD20、CD22;非系列特异性抗体：CD34、CD45、HLA-DR。

　　1.3 荧光标记染色方法 采用直接免疫荧光标记法，所有病例治疗前抽取骨髓进行免疫分型。首先每管加入Per CP标记的CD45，然后加入FITC与PE标记的抗体，同时设定阴性对照(FITC-IgG2a与PE-IgG1)，各管加入抗凝骨髓，避光孵育、溶血素裂解红细胞、PBS洗涤，上机检测。

　　1.4 流式细胞仪检测与分析 用Cellquest软件设置获取条件，依次上样获取数据，每管获取细胞数20000个，CD45/SSC双参数二维点图设门分析，计算幼稚细胞群中白血病细胞的表面标记。结果判定时以抗原表达量≥20%为阳性。

　　2 结果

　　2.1 细胞形态学检查结果 33例APL患者，M3a型22例，M3b型11例，POX染色阳性100%，AS-D染色阳性100%，NAE染色均不被NaF抑制。

　　2.2 M3患者CD45/SSC、FSC/SSC双参数二维散点。

　　2.3 33例M3患者免疫学表型结果

　　33例M3全部表达CD13、CD33，阳性率为100%，2例分别表达CD34和HLA-DR，其表达阳性率各为3.0%，CD117表达百分比为63.6 %，9例表达CD15，阳性表达率为27.2%，1例表达CD14，阳性表达率为3.0%。

　　3 讨论

　　白血病免疫学分型是利用McAb检测白血病细胞的细胞膜和细胞浆抗原，分析其表现型，以了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度，为临床合理治疗、判断疗效与预后提供重要的依据。随着流式细胞术的广泛应用，由于其客观准确、多参数、快速获取结果，且重复性好等优点，在白血病的诊断和分型方面具有十分重要的作用。应用流式细胞术进行白血病免疫学分型现已成为研究急性白血病的基本手段之一，是传统形态学检查的必要补充。APL是一种独特类型的急性髓细胞性白血病(AML)，以特殊的形态学、超微结构、细胞遗传学和临床表现为特征。目前APL的诊断主要依靠形态学和细胞酶学进行，即传统的FAB分型诊断。应用流式细胞仪进行白血病免疫学分型可提高APL的诊断准确率。本研究采用三色荧光标记流式细胞术CD45/SSC设门技术，分析检测FAB分型为AML-M3患者的骨髓表型特征。典型的APL以存在多颗粒的早幼粒细胞为特征，某些早幼粒细胞含有Auer小体。在流式细胞仪中SSC(侧向散射角)的大小与细胞颗粒度相关，本研究发现，AML-M3患者CD45/SSC的点图有其独特性，在CD45/SSC点图中，通常只见到两群细胞，其中正常淋巴细胞群比例减少(图1中R1)，而幼稚细胞群所占比例增高，且其SSC值较高(图1中R2)，位于中性粒细胞位置，平均达90%以上。CD13、CD33是髓系标志，在AML中有较高表达，本研究中33例M3全部表达CD13、CD33，阳性率为100%，且为共表达，其中多数患者CD33为完全表达，CD13为部分表达。CD33+、CD13+ (CD34-、HLA-DR-)被认为是M3特征性的免疫表型。CD34为造血干/祖细胞相关抗原，随细胞成熟其抗原的表达逐渐减弱直至消失，在正常细胞CD34的阳性表达率是(0.72±0.33)% ，而在急性白血病患者中的阳性率却很高，且在不同类型的白血病中CD34表达率不同[1]。有学者认为典型的APL应该不表达CD34[2]，另有研究表明[3]，CD34在APL中确有表达，阳性率为12.5%，明显低于其他类型白血病中的表达。本组33例中2例分别表达CD34和HLA-DR，其表达阳性率各为3.0%。有报道[4]CD34阳性APL患者缓解率明显低于CD34阴性患者，早期死亡及未缓解患者均表达CD34，提示CD34的表达对判断疗效和预后有一定的意义。CD117(c-kit)是一种由c-kit原癌基因编码的相对分子质量为145×103的跨膜蛋白受体，其配体为干细胞因子(SCF)。SCF是重要的造血生长因子，与其他细胞因子协同作用可刺激造血干/祖细胞的增殖和分化。SCF-CD117相互作用可能是干细胞生存的关键因素。正常骨髓细胞包括干细胞、定向祖细胞上CD117表达率为4%。有些学者认为APL患者的原始细胞很少表达CD117[5]，另有学者则认为APL患者原始细胞表达较高水平的CD117[6]。本研究中，CD117表达百分比为63.6 %，支持CD117在APL患者原始细胞表达较高水平的观点。国内学者刘艳荣[5]曾报道CD117在AML-M3患者中阳性率不高，但当改用不同公司生产的CD117抗体后，CD117阳性率明显增多。在进行白血病免疫学分析中，除了要求操作者有熟练的技术和经验外，所用抗体试剂质量的好坏也是影响检测结果的重要因素，否则会得出相反的结果，我们的经验是选用大公司的同一荧光素标记的单抗是提高检测结果准确性的质量保证。

　　【参考文献】

　　[1] 王兴兵，姚军霞，郑金娥，等. 115例急性髓细胞白血病多参数流式细胞术免疫表型分析[J].中国实验血液学杂志，2005，13(2):250-253.

　　[2] 邢娟娟，周欣，辜小汉. 624例白血病三色流式细胞术免疫表型分析[J]. 实用临床医学，2008，9(9)：9-11.

　　[3] 张宏，梁建英，李军,等. 71例急性白血病免疫表型特征分析及意义[J] 白血病•淋巴瘤，2004，13(2)：79-81.

　　[4] Legrang O，Perrot JY,Simonin G, et al. Adult biphenotypic acute leukemia: unentity with poor prognosis which is related to unfavourable cytogenetics and P-glycoprotein over-expression[J]. Br J Haematol,1998,100:47-55.

　　[5] 刘艳荣，付家瑜，常艳,等. CD117在白血病免疫分型中的意义 [J]. 中华检验医学杂志, 2000, 23(4):211-213.

　　[6] 万岁桂，徐 娟，巩文玉,等. 急性早幼粒细胞白血病中白血病细胞CD117的表达[J]. 首都医科大学学报,2004, 25(2):227-229.