细胞调控因子ＳＫＰ２的表达与 ＨＬ-６０／Ａ耐药的关系

　　作者：肖洁,尹松梅,谢双锋　　作者单位：中山大学第二附属医院血液内科， 广东 广州 510120

　　【摘要】 【目的】 观察细胞周期调控因子SKP2、P27kip1在白血病耐药细胞株HL-60/A和非耐药细胞株HL-60细胞中的表达及细胞周期比例，探讨细胞增殖与耐药的关系。 【方法】 RT-PCR、Western blot 检测SKP2、P27kip1、MRP mRNA及蛋白表达，流式细胞仪检测细胞周期，采用药物毒性分析方法检测细胞对化疗药物的敏感性。 【结果】 白血病耐药细胞株HL-60/A对阿霉素、柔红霉素、阿糖胞苷的耐药倍数分别为49.14倍、39.20倍和6.43倍;HL-60/A细胞MRP的表达高于HL-60; HL-60/A和HL-60细胞株G0/G1细胞期比例分别为(35.10 ± 0.81)%和(43.96 ± 1.12)%，两组比较P < 0.05;HL-60/A细胞中SKP2的表达高于HL-60细胞;P27kip1的表达低于HL-60细胞。 【结论】 HL-60/A细胞多药耐药机制产生与MRP的表达增高有关。耐药HL-60/A处于增殖期的细胞比例高，具有更高的增殖活性。

　　【关键词】 细胞周期,S期激酶蛋白2,多药耐药相关蛋白; 白血病

　　Abstract： 【Objective】 To observe the proportion of cell cycle and the expression of cell cycle regulators S-phase kinase-associated protein 2 (SKP2) and P27kip1 in drug-resistant leukemia cell line HL-60/A and drug non-resistant cell line HL-60， and to investigate the relationship between proliferation and multi-drug resistance of leukemia cells. 【Methods】 The expression of SKP2， P27kip1， and multi-drug resistance associated protein (MRP) mRNA were determined by RT-PCR and Western blot analysis. The cell cycle was analyzed by flow cytometry. Drug toxicity analysis was used to determine the sensitivity of the cells to chemotherapeutic drugs. 【Results】 Drug-resistant leukemia cell line HL-60/A showed 49.14-fold resistance to Adriamycin， 39.20-fold resistance to Daunorubicin， and 6.43-fold resistance to Arabinosylcytosine， respectively. MRP expression of HL-60/A cell was higher than that of HL-60 cell. The proportions of HL-60/A cells and HL-60 cells in the G0/G1 phase of the cell cycle were (35.10 ± 0.81)% and (43.96 ± 1.12)%， respectively (P < 0.05). The expression of SKP2 was significantly higher in HL-60/A cells than that in HL-60 cells， but the expression of P27kip1 in HL-60/A cells was lower. 【Conclusions】 The mechanism of multi-drug resistance of HL-60/A cell line is related to up-regulated expression of MRP. The proportion of drug resistant cell line HL-60/A at the proliferation stage is high which indicates that drug-resistant cells have higher proliferative activity.

　　Key words： cell cycle; S-phase kinase-associated protein 2; multi-drug resistance-associated protein; leukemia

　　白血病是常见的恶性血液肿瘤之一。目前，联合化疗是治疗急性白血病(acute leukemia， AL)的主要方法，但大约有20% ～ 30%的初治的AL患者始终不能缓解，有60% ～ 70%的患者完全缓解后复发。治疗失败的原因主要是白血病细胞对化疗药物原发或继发耐药[1-2]。为提高白血病的治愈率，提高白血病患者的无病生存期，要求研发新的治疗方法及化疗增敏剂。基因治疗作为疾病治疗的一种新手段，越来越受到人们的关注。本文从细胞周期调节与细胞耐药的关系着手，对敏感细胞株HL-60和耐药细胞株HL-60/A的细胞周期调控因子SKP2、P27kip1进行检测，探讨SKP2、P27kip1在白血病细胞中的表达与耐药的关系。为有效治疗白血病提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　1.1.1 细胞来源与细胞培养 HL-60细胞，中山大学药学院引进，培养在含100 mL/L胎牛血清(杭州四季青公司)、30 g/L谷氨酰胺，100 IU/mL青霉素，100 μg/mL 链霉素的RPMI1640培养基(美国Gibco)，置放于体积分数5% CO2、37 ℃恒温培养箱，隔2天传代1次。HL-60/A细胞购于中国协和医科大学血液病研究所。培养条件同上。

　　1.1.2 试剂与抗体单抗 小鼠抗人P27kip1单抗(IgG型)(美国 R&D system公司);小鼠抗人MRP(multi-drug resistance associated protein， MRP)单抗(IgG型)(美国 CHEMICON公司);小鼠抗人SKP2单抗(IgG型)(美国Zymed Laboratories公司);小鼠抗人GAPDH单抗(IgG)型(美国 CHEMICON公司);HRP标记的兔抗鼠IgG单抗(武汉博士德生物工程有限公司);MMuLV逆转录酶、Taq DNA酶(美国MBI公司)，琼脂糖(西班牙 Biowest公司);Phototope-HRP detection kit(美国 cell sigaling);Cell counting kit-8(日本 同仁化学研究所);阿糖胞苷(比利时 法玛西亚普强公司);阿霉素(中国深圳万乐制药有限公司);柔红霉素(中国深圳万乐制药有限公司)。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 细胞毒性分析 收集对数生长期的HL-60、HL-60/A细胞，1 000 r/min(r = 10 cm)离心5 min，去上清，再以完全培养基重悬，计数细胞，取96孔板，每孔接种1 × 105细胞，体积100 μL，每孔加入不同药物浓度的阿霉素、柔红霉素、阿糖胞苷。孵育24 h后加入37 ℃预热的CCK-8，在培养箱中继续孵育4 h，在450 nm处测吸光光度。每次同一条件做6个平行孔，重复4次。

　　1.2.2 细胞周期分布 收集对数生长期的HL-60、HL-60/A细胞，PBS洗涤2次，用PBS液重悬细胞，调整细胞密度为1 × 106/mL，取0.5 mL细胞悬液，加入2 mL 700 mL/L冰乙醇4 ℃过夜，2 000 r/min(r = 10 cm)离心5 min，弃上清，用PBS洗涤2次，加入50 mg/LRNA酶50 μL，50 mg/L碘化丙啶(propidium iodide， PI) 450 μL，37 ℃避光1 h，流式细胞仪检测细胞周期。

　　1.2.3 RT-PCR引物的设计与合成 SKP2，P27 kip1，MRP，β-actin引物以primer premier 5.0软件设计生成。SKP2上游引物：5′-GCC CCA ATC TTG TCC ATC TA-3′，下游引物：5′-CTG CGA TTC CAA AAA CT-3′，扩增产物为192 bp; P27 kip1上游引物：5′-CTT TTC ACT TCG GGC TGT GT-3′， 下游引物：5′-CAC AAA ACA TGC CAC TTT GG-3′，扩增产物为368 bp;MRP上游引物为：5′-CTT CGT TCT CAG GCA CAT CA-3′，下游引物：5′-GCC TCA TCC AAC ACA AGG AT-3′， 扩增产物为447 bp;β-actin 上游引物：5′-GTC CAC CTT CCA GCA GAT GT-3′，下游引物：5′-CAC CTT CAC CGT TCC AGT TT-3′，扩增产物为245 bp。由上海生工合成。

　　1.2.4 RT-PCR检测细胞的SKP2、P27 kip1、MRP、β-actin mRNA的表达 收集对数生长期的HL-60、HL-60/A细胞，PBS洗涤2次，用trizol核酸提取试剂盒(invitrogen公司)抽提细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA纯度(A260/A280 > 1.8)，并计算其含量，用去RNA酶去离子水调整RNA至浓度为0.5 μg/μL。取10 μL总RNA，加入多聚寡核苷酸1 μL，调整总体积为12 μL，混匀后70 ℃反应5 min，置于冰上。加入5 × 反应缓冲液4 μL，RNA酶抑制剂(20 U/μL) 1 μL，10 mmol dNTP 2 μL，离心后37 ℃孵育5 min。加入M-MuLV酶(200 U/μL) 1 μL，最后总体积为20 μL，42 ℃ 孵育60 min，70 ℃条件下孵育10 min，终止反应，置于冰上冷却。cDNA合成后保存于 -20 ℃ 冰箱。PCR反应取2 μL逆转录产物，分别加入10 × 缓冲液5 μL，10 mmol dNTP 1 μL，MgCl2 3 μL，上游引物(20 ?滋mol/L) 2.5 μL，下游引物(20 ?滋mol/L) 2.5 μL，Taq DNA酶(1 U/μL)1.5 μL，无菌双蒸水32.5 μL，总反应体系50 μL。SKP2扩增条件为95 ℃30 s预变性，94 ℃ 30 s变性，54 ℃ 30 s退火，72 ℃ 1 min延伸，共30个循环。P27 kip1的扩增条件为95 ℃ 30 s预变性，94 ℃ 30 s变性，54 ℃ 30 s退火，72 ℃ 1 min延伸，共30个循环。MRP扩增条件为95 ℃ 30 s预变性，94 ℃ 30 s变性，55.5 ℃ 30 s退火，72 ℃ 1 min延伸，共30个循环。β-actin扩增条件为95 ℃ 30 s预变性，94 ℃ 30 s变性，55℃ 30 s退火，72 ℃ 1 min延伸，共30个循环。以上PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪上观察结果并摄相。

　　1.2.5 Western-blot方法检测细胞中SKP2、P27 kip1、MRP、GAPDH蛋白的表达 收集对数生长期的HL-60、HL-60/A细胞，PBS洗涤2次，取RIPA裂解液(强)，并在临用前加入PMSF，使其终浓度为1 mmol/L。每1 × 106细胞中加入200 μL细胞裂解液，冰上充分裂解，100 ℃水浴中反应15 min，4 ℃、12 000 g离心15 min，上清液保存于 -80 ℃冰箱中备用。取部分上清液用BCA法测定蛋白浓度，并调节各组蛋白浓度。取上清加入5 × 上样缓冲液煮沸5 min备用，采用SDS-PAGE电泳，SKP2、P27 kip1、β-actin蛋白电泳的分离胶浓度为12%，MRP的分离胶浓度为6%，垂直电泳条件为45 min，200 V。SKP2、P27 kip1、GAPDH蛋白的电转条件为90 min，100 V，MRP的电转条件为180 min，80 V。取出电转后的PVDF膜，TBS/T冲洗两次后封闭液室温封闭1 h。封闭后TBS/T洗3次，加入一抗，4 ℃摇床过夜，TBS/T洗3次，加入二抗室温孵育2 h，TBS/T洗3次，进行蛋白的检测及图象分析。将膜上的液体控干，置于平皿中，加入10 mL发光液LumiGLO，反应1 min。暗室中曝光X线片1 ～ 3 min，显影30 ～ 60 min，定影10 min。清水冲洗后晾干。

　　1.3 统计分析

　　计量资料的描述用均数 ± 标准差(x ± s)，两独立样本均数的比较用t检验，检验水准定为P < 0.05有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 HL-60/A细胞具有多药耐药性

　　ADR对HL-60细胞的半数抑制浓度(Inh ibitory concentration 50， IC50)是0.044 μg/mL，对HL-60/A细胞的IC50是2.162 μg/mL，耐药倍数49.14倍。DNR对HL-60细胞的IC50是0.035 μg/mL，对HL-60/A细胞的IC50是1.388 μg/mL，耐药倍数39.20倍。Ara-C对HL-60细胞的IC50是0.04 μg/mL，对HL-60/A细胞的IC50是0.24 μg/mL，耐药倍数6.43倍(图1)。

　　2.2 HL-60/A细胞中MRP的表达高于HL-60细胞

　　RT-PCR检测HL-60和HL-60/A细胞MRP mRNA的表达，与内参β-actin的比值表示表达量。HL-60和HL-60/A细胞MRP mRNA的表达分别为(0.34 ± 0.12)%和(0.60 ± 0.07)%，差异有统计学意义(t = -4.4， P = 0.004，图2)。Western blot检测细胞MRP蛋白的表达，与内参GAPDH的比值表示表达量。MRP蛋白的表达分别为(0.20 ± 0.02)%和(0.60 ± 0.04)%，两者比较差异有统计学意义(t = -16.4， P = 0.000，图3)。

　　2.3 HL-60/A细胞SKP2的表达高，P27kip1的表达低

　　RT-PCR检测HL-60和HL-60/A细胞SKP2、P27kip1 mRNA的表达，与内参β-actin的比值表示表达量。HL60和HL-60/A细胞中SKP2 mRNA的表达水平分别为(0.52 ± 0.01)%和(0.83 ± 0.03)%，差异有统计学意义(t = -19.1， P = 0.000)。P27kip1 mRNA的表达分别为(0.75 ± 0.04)%和(0.41 ± 0.05)%，差异有统计学意义(t = 11.8， P = 0.000，图2)Western blot检测HL60和HL-60/A细胞SKP2、P27 kip1蛋白的表达，与内参GAPDH的比值表示表达量。HL60和HL-60/A细胞SKP2蛋白的表达分别为(0.27 ± 0.045)%和(0.58 ± 0.06)%，两者比较差异有统计学意义，(t = -7.4， P = 0.002);P27 kip1蛋白的表达分别为(0.63 ± 0.13)%和(0.30 ± 0.13)%，两者比较差异有统计学意义(t = 3.1， P = 0.037，图3)

　　2.4 HL-60/A细胞株处于G1期细胞比例高

　　用流式细胞仪检测HL-60和HL-60/A两组细胞周期的分布。G0/G1期分别为：(43.96 ± 1.12)%、(35.10 ± 0.81)%，差异有统计学意义(t = 11.1， P = 0.001)。S期分别为：(49.85 ± 0.91)%、(55.56 ± 0.95)%，差异有统计学意义(t = -7.5， P = 0.002)。G2-M期分别为：(6.19 ± 1.52)%、(9.34 ± 0.25)%，差异有统计学意义(t = -3.5， P = 0.066)。耐药细胞处于增殖周期中S期及G2-M期的比例高于敏感细胞(图4)。

　　3 讨 论

　　白血病耐药发生的机制与多药耐药基因(multi-drug resistance， MRD)的表达有关。多药耐药相关蛋白(multi-drug resistance associated protein， MRP)是一种分子量为190 ku的膜糖蛋白，隶属于ATP结合盒式载体(ATP-binding cassette， ABC)超家族蛋白质[3]。Wada等[4]通过药物浓度梯度压力递增培养法，在含阿霉素培养基中传代培养的HL-60/DOX细胞对阿霉素、吡柔比星、长春新碱、足叶乙甙有交叉耐药，并证明HL-60/DOX多药耐药的发生与MRP的表达有关，HL-60/DOX细胞对阿霉素的外排作用增强。本实验中的HL-60/A细胞购于天津中国协和医科大学血液病研究所。经药物浓度梯度压力递增法培养，通过药物毒性分析表明，HL-60/A具有多药耐药性，对阿霉素、柔红霉素、阿糖胞苷的耐药倍数分别是49.14、39.20、6.43倍，经RT-PCR和Western blot检测HL-60/A细胞中MRP的表达明显高于HL-60细胞。证明细胞的多药耐药性确与多药耐药相关蛋白MRP的表达相关，本研究的结果与Wada等的结果一致。

　　正常哺乳动物细胞在内外因子的调节下有序的循着细胞周期，不断分裂增生及凋亡，保持动态平衡。肿瘤细胞的增殖平衡失调，细胞出现无限制的增殖和凋亡减慢。细胞失控性增生与肿瘤的发生发展有重要的意义。国内有作者对耐药的A549/DDP细胞与非耐药的A549细胞进行对比研究发现：A549/DDP细胞处于细胞周期G1期的细胞比例明显低于A549细胞，耐药细胞的增殖能力增强[5]。在本实验中，耐药细胞HL-60/A较HL-60而言，处在G0/G1期的细胞比例减少，而S期、G2-M期的细胞比例高，证明HL-60/A的增殖周期更短，增殖能力高于HL-60。

　　细胞的增殖依赖于细胞周期正负调控因子的调控。S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase- associated protein 2， SKP2)是一个与细胞周期调控密切相关的基因，参与细胞周期调控因子的蛋白泛素化过程[6]。其中，P27kip1是SKP2最常见的底物之一[7]。P27kip1是一个相对分子质量为27 KD的热稳定性蛋白，主要对细胞周期进程起负调控作用，阻滞细胞于G0/G1期，阻止细胞进入S期。Agarwal A[8]等体内研究证明SKP2的高表达促进肿瘤的生成，而抑制SKP2的表达，稳定胞核内P27kip1水平有利于肿瘤的治疗。有研究表明，在一些恶性实体肿瘤，P27kip1的表达与SKP2呈负相关，并认为二者是患者独立的预后因素，可能成为新的分子治疗靶点[9]。在白血病的研究中也得到同样的结果。Yokozawa等[10]发现P27kip1高表达的AL患者的无病生存率明显高于P27kip1低表达的患者。提示P27kip1是独立的预后因素。Min等人[11]研究发现SKP2的表达与急性非淋巴细胞白血病不良的细胞遗传学特性有关，SKP2高表达患者无病生存时间短，完全缓解率低。我们对白血病HL-60和HL-60/A进行检测，发现白血病HL-60的SKP2的表达显著低于HL-60/A，而前者的P27kip1显著高于后者，与国外的研究结果一致。

　　在本实验中，我们通过RT-PCR和Western blot方法检测HL-60和HL-60/A细胞中SKP2、P27kip1的表达发现：药物敏感性高的白血病细胞癌基因SKP2的水平低，抑癌基因P27kip1的表达水平高;对化疗不敏感的白血病细胞SKP2、P27kip1的表达结果相反。SKP2的表达可能是影响白血病耐药的潜在因素，SKP2有望成为一种白血病基因治疗新靶点。实验中我们还观察到HL-60/A处于增殖周期S期及G2-M期比例增多，说明HL-60/A不仅对化疗药物不敏感，而且具有更强的增殖能力，使白血病患者难以达到完全缓解。

　　【参考文献】

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　　3 Kruh GD， Chan A， Myers K， et al. Expression complementary DNA library transfer establishes mrp as a multidrug resistance gene [J]. Cancer Res， 1994，54(7)：1649-1652.

　　4 Wada H， Saikawa Y， Niida Y， et al. Selectively induced high MRP gene expression in multidrug-resistant human HL60 leukemia cells [J]. Exp Hematol， 1999，27(1)：99-109.

　　5 梁兴杰，黄振华，路艳蒙，等. 肺腺癌A549/DDP细胞周期变化几其多药耐药性 [J]. 生物化学与生物物理进展， 2000，27(6)：616-620.

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　　8 Agarwal A， Bumm TG， Corbin AS， et al. Absence of SKP2 expression attenuates BCR-ABL-induced myelo-proliferative disease [J]. Blood， 2008，112(5)：1960-1970.

　　9 Kataqiri Y， Hozumi Y， Kondo S. Knockdown of Skp2 by siRNA inhibits melanoma cell growth in vitro and in vivo [J]. J Dermatol Sci， 2006，42(3)：215-224.

　　10 Yokozawa T， Towatari M， Iida H， et al. Prognostic significance of the cell cycle inhibitor p27Kip1 in acute myeloid leukemia [J]. Leukemia， 2000，14(1)：28-33.

　　11 Min YH， Cheong JW， Lee MH， et al. Elevated S-phase kinase-associated protein 2 protein expression in acute myelogenous leukemia： its association with constitutive phosphorylation [J]. Clin Cancer Res， 2004，10(15)：5123-5130.