毒胡萝卜素诱导K562细胞凋亡及其机制的实验研究

　　作者：冯献启,游泳,肖娟,邹萍　　作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院血液病研究所，武汉 430022

　　【摘要】本研究旨在探讨毒胡萝卜素对K562细胞的凋亡诱导作用及其可能机制。采用荧光显微镜观察凋亡细胞的形态变化，annexinⅤ-FITC/PI双染法FCM检测凋亡率的变化，Ca2+荧光指示剂Fura-2/AM法荧光分光光度计测定细胞内Ca2+浓度(〖Ca2+]i)的改变，Rh123单染法FCM检测线粒体ΔΨm的变化，Western blot检测caspase-3，-7，-9，-12、细胞色素 C和GRP78蛋白的改变。结果显示：4 μmol/L 毒胡萝卜素作用K562细胞48小时后，荧光显微镜观察到细胞呈典型的凋亡形态变化，早期凋亡细胞核染色质呈固缩状、圆珠状或斑块状;晚期凋亡细胞核染色质呈固缩状或斑块状。1、2、4、8 μmol/L 毒胡萝卜素作用K562细胞24和 48小时后细胞凋亡率分别为7.51%、11.65%、23.22%、30.56%和12.85%、20.27%、31.51%、44.16%，在一定范围内呈剂量和时间依赖性，与对照组比较，均有统计学意义(P<0.05)。毒胡萝卜素诱导K562细胞〖Ca2+]i升高以及线粒体ΔΨm下降，并均呈一定的浓度依赖性，与对照组比较，均有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测显示，毒胡萝卜素诱导K562细胞caspase-3，-7，-9，-12剪切活化、细胞色素C释放、GRP78表达上调。结论:毒胡萝卜素可诱导K562细胞发生内质网应激反应性凋亡，内质网是细胞内诱导凋亡的一个重要新场所;caspase-3，-7，-9，-12剪切和活化、线粒体ΔΨm破坏和细胞色素C释放是毒胡萝卜素诱导K562细胞凋亡的重要机制之一，线粒体参与内质网应激反应性凋亡途径并发挥重要作用。

　　【关键词】 毒胡萝卜素

　　Abstract The aim was to study the apoptotic induction effect of thapsigargin on leukemia cell line K562 and its possible mechanism. After the treatment of leukemia cell line K562 by thapsigargin，morphological change of apoptotic cells was investigated by AO/EB fluorescent staining under fluorescent microscope;apoptosis rate was determined with annexinⅤ-FITC/PI double staining by flow cytometry;intracellular calcium concentrations (〖Ca2+]i) were measured by fluorescence spectrophotometer with calcium sensitive fluorescence indicator Fura-2/AM;mitochondrial transmembrance potentials (ΔΨm) was detected on flow cytometry through staining of Rhodamine (Rh123);the changes of caspase-3，-7，-9，-12、cytochrome C、GRP78 proteins were detected by Western blot. The results showed that K562 cells cultured in 4 μmol/L thapsigargin for 48 hours exhibited typical morphological changes of apoptotic cells under fluorescent microscope，including shrinkage of cell，condensation of chromatin，breakage of nuclear，formation of apoptotic bodies，fluorescence of yellow green and pellet observed in early apoptoyic cells and hyacinth fluorescence of chromatin showed in late apoptotic cells. 24 and 48 hours after exposure to 1，2，4，8 μmol/L thapsigargin，the apoptotic rates of K562 were respectively 7.51%，11.65%，23.22%，30.56% and 12.85%，20.27%，31.51%，44.16%，in dose- dependent manner，and were statistically significant when compared with the controls (P<0.05). The apoptotic rate of K562 was dose- and time-dependent in experiment range. The enhancement of 〖Ca2+]i and the decrease of the ΔΨm in K562 cells were induced by thapsigargin and were dose-depend ent in experiment range，compared with control，P<0.05. Western blot results indicated that cleavage and activation of caspase-3，-7，-9，-12，releasing of cytochrome C from mitochondria，upregulation of GRP78 expression at the endoplasmic reticulum were induced in K562 cells after 24 hours exposure of 4 μmol/L thapsigargin. It is concluded that thapsigargin induces endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis in K562 cells. Endoplasmic reticulum is a novel important initiatory site of apoptosis in cells;the cleavage and activation of caspase-3，-7， -9，-12 play very important role in endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis of K562 cells and is one of the important mechanisms for thapsigargin-induced apoptosis. Thapsigargin-induced apoptosis in K562 cells is

　　associated closely with the disruption of the ΔΨm and the release of cytochrome C from mitochondria，mitochondria participates in endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis in K562 cells.

　　Key words thapsigargin;leukemia cell line;K562 cell;apoptosis;endoplasmic reticulum;caspase

　　化疗是目前治疗白血病的主要手段。虽然造血干细胞移植术是治疗白血病的理想方法，但是大部分患者由于无合适供者或不适合移植最终因化疗无效而死亡。白血病化疗无效的主要原因是白血病细胞突变及原发或继发耐药。因此，临床上亟需寻找针对白血病细胞内不同靶位点的新疗法。最近研究发现，内质网可能是细胞内诱导凋亡的一个新场所，即内质网应激反应性凋亡途径，它不同于经典的凋亡途径：死亡受体途径和线粒体途径[1，2]。作为一种新的凋亡通路，其确切机制尚未完全清楚。本研究以白血病细胞系K562细胞为研究对象，以内质网Ca2+-ATP酶抑制剂毒胡萝卜素(thapsigargin，TG)为内质网应激诱导剂，初步探讨TG对K562细胞的凋亡诱导作用及其可能机制，为开辟白血病化疗新方案提供一定的实验和理论依据。

　　材料和方法

　　试剂和细胞系

　　细胞系K562细胞为本室常规培养;小牛血清、RPMI 1640培养液均购自Gibco公司;吖啶橙(AO)、溴化乙锭(EB)为Sigma公司产品;兔抗人caspase-3，-12，GRP78多克隆抗体、 鼠抗人caspase-7，-9，细胞色素C单克隆抗体、毒胡萝卜素、Ca2+荧光指示剂Fura-2/AM、化学发光剂LumiGLO、annexinⅤ-FITC试剂盒均购自晶美生物工程有限公司;考马斯亮兰CBBG250蛋白测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所;荧光染料Rh123、Western blot常规试剂均购自北京中山生物技术有限公司。

　　细胞培养

　　K562细胞于含10%小牛血清、青霉素、链霉素各100 U/ml的RPMI 1640培养液中，37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱常规传代培养。实验分组：对照组(只加二甲亚砜)和试验组(加不同浓度的毒胡萝卜素)，每次实验重复3次。

　　荧光显微镜观察

　　取对照组和4 μmol/L 毒胡萝卜素作用48小时的试验组K562细胞，制备细胞悬液，浓度为1×107/ml;取95 μl细胞悬液，对对照组和试验组各加2 μl吖啶橙(100 μg/ml)和溴化乙锭(100 μg/ml)贮存液，染色10分钟;滴加1滴染色的细胞悬液于洁净载玻片上，直接用盖玻片封片;荧光显微镜下观察凋亡细胞形态并照相。

　　细胞凋亡的FCM检测

　　采用annexinⅤ-FITC/PI双染法FCM检测。方法参照试剂盒说明书进行：1、2、4、8 μmol/L的毒胡萝卜素作用K562细胞24和48小时后，分别收集对照组和试验组细胞，PBS充分洗涤细胞，取总数约为(5-12.5)×104/ml;用250 μl结合缓冲液(用dH2O 1∶4稀释)重悬细胞并使其浓度为(2-5)×105/ml;取195 μl的细胞悬液加入5 μl annexinⅤ/FITC，混匀后于室温避光孵育10分钟;用190 μl的结合缓冲液洗细胞1次，用190 μl的结合缓冲液重悬细胞，加入10 μl 20 μg/ml的碘化丙锭溶液(终浓度为1 μg/ml);室温避光孵育30分钟，上FCM分析。

　　细胞内Ca2+浓度(〖Ca2+]i)的测定

　　取对数生长期K562细胞，台盼蓝拒染实验检查，细胞活性95%以上。调整细胞终浓度为2×105/ml，加入终浓度分别为0、1、2、4 μmol/L毒胡萝卜素，于37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱孵育24小时，收集细胞并调整细胞浓度为2×106/ml，将细胞悬液于37℃预热5分钟，加入Fura-2/AM(终浓度为5 μmol/L)，37℃恒温震荡45分钟后，以含0.2%牛血清白蛋白的Hank液洗涤2次，用完全RPMI/HEPES重悬细胞并调整细胞悬液为2×106/ml。测定之前细胞预先于37℃复温2-3分钟。荧光测定采用日立F-2000型荧光分光光度计(日本)。激发波长为340 nm和380 nm，发射波长为500 nm，激发光栅为10 nm，发射光栅为5 nm。由下述公式计算： 〖Ca2+]i=Kd(Fo/Fs)〖(R-Rmin )/(Rmax-R)]

　　式中 Rmax和Rmin分别为最大和最小的荧光比值，即是在存在于大于1mmol/L游离钙离子浓度和存在于至少高于此钙离子浓度两倍的EGTA时，分别加入0.1% Triton-X100后所测得的340 nm/380 nm荧光比值，Fo和Fs分别代表Ca2+为零和饱和状态下在380 nm波长测得的荧光强度，Kd为Fura-2与Ca2+反应的解离常数，为224 nmol/L。

　　线粒体ΔΨm变化的FCM检测

　　取对照组和试验组细胞，分别收集1×106个细胞，PBS洗涤2次后，重悬于10 μg/ml的 Rh123(由线粒体摄取的阳离子亲脂染料，细胞内Rh123的摄取量与线粒体跨膜电位ΔΨm变化呈正相关)中，在37℃、5% CO2条件下孵育30分钟，PBS洗涤2次，然后上FCM进行Rh123荧光强度测定。

　　caspase-3，-7，-9，-12、细胞色素 C、GRP78蛋白水平变化的Western blot检测

　　实验方法参照《分子克隆实验指南》进行。4 μmol/L 毒胡萝卜素作用K562 细胞24小时后，分别收集对照组和试验组细胞，用冰预冷PBS洗涤细胞3次，加入细胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，0.1% SDS，1% NP40，0.5% 去氧胆酸钠，1 mmol/L EDTA，1 μg/ml aprotinin，100 μg/ml PMSF，pH 8.0)，使细胞浓度为1×107/ml，涡旋混匀后冰浴30分钟，4℃ 12000×g离心10分钟，收集上清液，用考马斯亮兰CBBG250蛋白测定试剂盒测定蛋白质浓度。样品与等体积的2×上样buffer混匀，煮沸5分钟，用7.5%或12.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳分离。分离的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭1小时后，与第一抗体孵育1小时，然后加入辣根过氧化物酶标记的抗鼠或兔IgG第二抗体共同孵育1小时，LumiGLO显色发光，暗室X-ray胶片曝光，胶片用JS-300凝胶图像分析仪(Sx Image软件分析系统)进行扫描分析处理。

　　统计学处理

　　数据采用x±SD表示，采用SPSS 10.0统计软件，均数间进行独立样本t检验。

　　结 果

　　凋亡细胞形态观察

　　实验组 K562 细胞经 4 μmol/L 毒胡萝卜素作用 48 小时后，AO/EB 双染色荧光显微镜下K562细胞分为4种细胞形态。① 活细胞： 核染色质均匀，呈正常结构;② 早期凋亡细胞:核染色质呈固缩状、 圆珠状或斑块状;③ 晚期凋亡细胞:核染色质呈固缩状或斑块状;④ 坏死细胞:核染色质均匀，呈正常结构。而正常对照组大多数K562细胞呈活细胞，核染色质均匀，呈正常结构;有少量的凋亡细胞。结果见图1。

　　细胞凋亡率变化

　　经annexinⅤ-FITC/PI双染法FCM检测显示，不同浓度的内质网Ca2+-ATP酶抑制剂毒胡萝卜素诱导K562细胞发生典型的细胞凋亡，在一定范围内呈浓度和时间依赖性，随浓度的增加细胞凋亡率增加，并且随时间的延长凋亡率亦增加。1、2、4、8 μmol/L毒胡萝卜素作用K562细胞24和48小时 后细胞凋亡率分别为7.51%、11.65%、23.22%、30.56%和12.85%、20.27%、31.51%、44.16%，各组与对照组比较，均有统计学意义(P<0.05)。

　　毒胡萝卜素对细胞〖Ca2+]i变化的影响

　　静息状态下，K562细胞〖Ca2+]i为(77.15±0.58) nmol/L，K562细胞经1、2、4 μmol/L毒胡萝卜素作用24小时后〖Ca2+]i分别为(90.43±1.41)nmol/L 、(165.99±0.55)nmol/L 和(172.53±0.67)nmol/L，与静息状态对照组比较，实验组K562细胞〖Ca2+]i明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，并且细胞〖Ca2+]i升高在一定范围内具有明显的浓度依赖性。这表明毒胡萝卜素抑制内质网Ca2+-ATP酶活性，诱导内质网储存Ca2+释放，从而升高胞浆内Ca2+浓度。

　　线粒体ΔΨm变化

　　Rh123是由线粒体吸收的阳离子亲脂染料，其摄取量与线粒体ΔΨm呈正相关。经流式细胞仪分析Rh123荧光强度观察线粒体跨膜电位ΔΨm的变化，结果显示胡萝卜素可诱导K562细胞线粒体ΔΨm下降，并呈一定的浓度依赖性，与对照组比较，均有统计学意义(P<0.05)，这表明线粒体参与了毒胡萝卜素诱导的K562细胞凋亡途径。结果见图2。

　　Caspase-3，-7，-9，-12、细胞色素 C、GRP78蛋白水平变化

　　Western blot检测结果显示，K562细胞经4 μmol/L 毒胡萝卜素作用24小时后，内质网伴侣蛋白GRP78表达明显增加，GRP78是内质网应激反应的主要标志分子之一，表明毒胡萝卜素诱导K562细胞发生了内质网应激反应;caspase-3，-7，-9，-12水平均出现不同程度的下降，尤其是caspase-3几近消失，表明它们均发生了剪切活化;细胞色素 C明显增加，表明线粒体释放细胞色素 C增加。以上结果表明，毒胡萝卜素诱导K562细胞发生了内质网应激反应性凋亡，caspase-3，-7，-9，-12的剪切活化、线粒体细胞色素C的释放是毒胡萝卜素诱导K562细胞发生内质网应激反应性凋亡的重要机制之一，线粒体参与K562细胞内质网应激反应性凋亡途径或线粒体凋亡途径与内质网凋亡途径存在内在联系。

　　讨 论

　　DNA损伤和细胞膜死亡受体聚集长期以来被认为是诱导线粒体膜通透性改变和(或)caspases直接活化的细胞凋亡始动点[3]。越来越多的证据表明，内质网、溶酶体和高尔基体等其他细胞器也是损伤感知或凋亡信号整合的主要位点[3]。最近研究发现，内质网可能是细胞内诱导凋亡的一个新场所，并提出了内质网应激反应性凋亡途径。内质网广泛存在于真核细胞中，是蛋白质合成、折叠和运输以及细胞内Ca2+储存的主要场所，对细胞应激反应、细胞内Ca2+水平以及蛋白质合成、折叠和运输具有重要调节作用[1，2]。当新合成的蛋白质N末端糖基化、二硫键形成以及蛋白质由ER向高尔基体转运等过程受阻时，非折叠或非正确折叠的新合成蛋白质在内质网中大量堆积，称之为非折叠蛋白质反应。同时，内质网也是细胞内Ca2+的重要储存场所，在细胞内Ca2+稳态、细胞功能维持以及细胞内信号传导等过程中发挥重要作用。内质网的Ca2+稳态改变和内质网非折叠或非正确折叠蛋白质的堆积均可引起内质网应激反应，如果内质网Ca2+稳态改变或/和非折叠蛋白质反应得不到纠正，将最终诱导细胞凋亡[1-3]。

　　内质网应激反应性凋亡作为一种新的凋亡通路，其确切机制尚未完全清楚。本研究以毒胡萝卜素作为内质网应激诱导剂，探讨了其对白血病细胞系K562细胞的凋亡诱导作用以及可能机制。毒胡萝卜素是20世纪70年代从欧洲人用于缓解风湿痛的经典草药Thapsiagarganica的根部提取的一种倍半萜烯内酯[4]。研究发现，其作用位点是抑制内质网膜Ca2+-ATP酶，诱导胞浆内Ca2+浓度上升和内质网储存钙的下降[5，6]。我们的实验结果表明，K562细胞经4 μmol/l毒胡萝卜素作用48小时后，荧光显微镜观察显示细胞呈典型的凋亡形态改变，细胞体积变小，早期凋亡细胞核染色质呈固缩状、圆珠状或斑块状，晚期凋亡细胞核染色质呈固缩状或斑块状(图1)。毒胡萝卜素诱导K562细胞凋亡在一定范围内呈浓度依赖性，随浓度的增加细胞凋亡率增加，并且随时间的延长凋亡率亦增加。1、2、4、8 μmol/L毒胡萝卜素作用K562细胞24和48小时后，细胞凋亡率分别为7.51%、11.65%、23.22%、30.56%和12.85%、20.27%、31.51%、44.16%，这表明随毒胡萝卜素诱导K562细胞内质网应激反应强度和持续时间的增加，细胞凋亡率随之增加。葡萄糖调节蛋白GRP78是定位于内质网腔内的一种分子伴侣蛋白，是内质网应激反应的标志分子之一。Western blot结果显示，4 μmol/l毒胡萝卜素作用24小时后，K562细胞表达GRP78明显增加，表明毒胡萝卜素诱导K562细胞发生了内质网应激反应;同时caspase-3，-7， -9，-12水平均出现了不同程度的下降，尤其是caspase-3几近消失，表明caspase-3，-7，-9，-12在毒胡萝卜素诱导的K562细胞内质网应激反应性凋亡过程中发生了剪切、活化，并在此凋亡途径中发挥重要作用;胞浆细胞色素 C胞浆水平明显增加，表明细胞色素 C从线粒体释放增加，这与线粒体跨膜电位ΔΨm下降的结果相一致，均表明线粒体参与了毒胡萝卜素诱导的K562细胞内质网应激反应性凋亡过程。因此，caspase-3，-7，-9，-12的剪切活化、细胞色素C从线粒体释放可能是毒胡萝卜素诱导K562细胞发生内质网应激反应性凋亡的重要机制之一。据报道，caspase-12定位于内质网，可能是介导内质网应激反应性凋亡的关键分子，在死亡受体或线粒体凋亡途径中不被活化，并且caspase-12缺陷鼠能抵抗内质网应激反应性凋亡而对其他死亡刺激仍可发生凋亡[2，7，8]，但Nakagawa等[2]研究发现，caspase-12缺陷鼠的胚胎纤维母细胞并没有完全抵抗内质网应激反应性凋亡，表明内质网应激反应性凋亡可能存在caspase-12非依赖性信号通路。毒胡萝卜素诱导K562细胞线粒体释放细胞色素C并进而活化caspase-9的过程可能是caspase-12非依赖性的。Morishima等[9]和Rao 等[10]报道，活化的caspase-12以细胞色素C和Apap-1非依赖性方式剪切活化caspase-9，活化的caspase-9又剪切活化caspase-3并被caspase-9特异性抑制剂所抑制，同时还发现活化的caspase-12微弱地剪切caspase-7。同时也有报道，在内质网应激反应性凋亡过程中发现有细胞色素C从线粒体释放，表明在特定的细胞类型中内质网应激反应性凋亡途径与线粒体凋亡途径可能存在联系[11-13]。本研究表明，毒胡萝卜素诱导的K562细胞内质网应激反应性凋亡与caspase-3，-7，-9，-12剪切、活化有关，而且在凋亡过程中线粒体膜电位ΔΨm呈浓度依赖性下降，线粒体释放cytochrome C增加，这可能是caspase-9剪切、活化的机制之一，同时也表明线粒体凋亡信号参与了K562细胞内质网应激反应性凋亡过程。有报道内质网应激反应性凋亡能增加线粒体对凋亡刺激的敏感性[14]。本研究还发现，毒胡萝卜素能增加多药耐药细胞系K562/ADM对阿霉素、柔红霉素、长春新碱、VP16、高三尖杉酯碱、米托蒽醌化疗药物的敏感性，即能部分逆转多药耐药性，这可能与药物泵P-gp功能改变(与P-gp表达量无关)和增加线粒体凋亡敏感性有关(资料未显示)。

　　本研究初步探讨了毒胡萝卜素诱导K562细胞发生内质网应激反应性凋亡及其机制。随着对内质网应激反应性凋亡途径研究的深入，其在疾病发生发展、肿瘤形成及其耐药中作用正引起人们的关注，同时为相关疾病尤其是肿瘤的治疗提供了新的方向。本研究可能为白血病化疗提供了新方案并奠定了一定的实验和理论依据。

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