循环酶法测定血浆同型半胱氨酸的方法学评价
发表时间：2011-10-13 浏览次数：533次
作者：陈继中 作者单位：铜陵市人民医院，安徽 铜陵 244000
【摘要】目的:评价测定血浆同型半胱氨酸(HCY)的循环酶方法。方法：血浆氧化型同型半胱氨酸经三乙羧乙基膦(TCEP)还原成游离型HCY，基于HCY甲基转移酶(HMTase)，S腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHase)构成的循环酶体系以及脱氢酶辅酶体系的原理，用自动生化分析仪测定血浆HCY。结果：测定线性范围达1.5 μmol/L～50.0 μmol/L;批内CV分别为2.1%、1.7%;日间CV分别为3.7%、4.1%，总CV分别为4.9%、5.2%;回收率96.8%～101.3%;本法和高效液相色谱法比较：R2=0.9737，Y=0.972X+1.595。t=2.01，P>0.05，差异无显著性;血氨<50.0 μmol/L，三酰甘油<11.0 mmol/L，抗坏血酸<10.0 mmol/L，胆红素<500.0 μmol/L，血红蛋白<2.0 g/L，谷胱甘肽<0.05 mmol/L时，对结果无明显干扰。结论：本方法具有简便、灵敏等特点，适合血浆HCY的常规和自动化分析。
【关键词】 同型半胱氨酸,循环酶法,高效液相色谱
近年来，越来越多的临床和基础研究证据显示同型半胱氨酸(HCY)是心脑血管以及周围血管阻塞性疾病的独立危险因素[1]。目前，测定同型半胱氨酸的方法有很多种，包括高效液相色谱法(HPLC)、氨基酸分析仪法、荧光偏振免疫分析(FPIA)和放射性酶联免疫吸附法[2]、酶学分析法。其中HPLC法是最常用的方法，但是需要特殊设备。循环酶法是利用酶的底物特性，放大靶物质(被测物)的检测方法，此法仅循环靶物质，具有快速、简便、灵敏度高，易于自动化等特点。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 全自动生化分析仪(日立7170A型)，高效液相色谱仪(日本分光JASCo Pu1580型)。同型半胱氨酸检测试剂(北京九强公司)包括试剂Ⅰ：S腺苷甲硫氨酸(SAM)0.1 mmol/L，NADH 0.2 mmol/L，三乙羧乙基膦(TCEP) 0.5 mmol/L，α酮戍二酸5.0 mmol/L。试剂Ⅱ：HCY甲基转移酶(HMTase)5.0 ku/L，谷氨酸脱氢酶10 ku/L。试剂Ⅲ：S腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHase)3.0 ku/L，腺苷脱氨酶5.0 ku/L。DL同型半胱氨酸(美国Sigma公司)，同型半胱氨酸标准液(批号：02/2006;050429)：6.5 μmol/L和28.0 μmol/L。
1.2 测定原理 在TCEP作用下，氧化型同型半胱氨酸转化为游离型HCY，游离型HCY与共价底物S腺苷甲硫氨酸(SAM)在HCY甲基转移酶催化下反应形成蛋氨酸(Met)和S腺苷同型半胱氨酸(SAH)，SAH被SAH水解酶水解成腺苷和HCY，形成的HCY可以循环加入反应，从而放大检测信号，腺苷(Ado)水解为次黄嘌呤和氨，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下，使NADH转化为NAD+，样本中的HCY的浓度与NADH的变化成正比，反应式如下：
1.3 测定方法
1.3.1 三试剂方法 反应类型：两点速率法;波长340 nm(主)/405 nm(副);温度37℃，反应时间10 min，参考用量：样品15 μl，R1 240 μl，R2 30 μl，R3 25 μl。
1.3.2 高效液相色谱法参考有关文献方法[3]
1.4 方法学评价指标 进行方法的回收试验，干扰试验，精密性、线性范围及方法对比试验。
2 结果
2.1 精密度 按照NCCLS( EP5T2)文件的评价方案，取6.5 μmol/L和28.0 μmol/L的同型半胱氨酸标准液各一份，用循环酶法将此两份标本每天上午、下午双份测定，连续20 d。结果批内CV分别为2.1%、1.7%;日间CV分别为3.7%、4.1%，总CV分别为4.9%、5.2%。
2.2 回收实验 向450 μl血清中加入50 μl的生理盐水作为基础样本，测得HCY浓度为6.3 μmol/L，向同体积的血清标本中分别加入50 μl的浓度为50.0 μmol/L和200.0 μmol/L的HCY标准品，使其终浓度分别为11.3 μmol/L和26.3 μmol/L，每一浓度作平行管，测得其回收率为96.8%～101.3%。
2.3 线性实验 配制HCY浓度为2 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L、50 μmol/L的参考物，用本法测定，理论值(X)与测定值(Y)之间的线性回归：Y=0.998 6X+0.605 5，R2=0.996 6，HCY浓度在1.5 μmol/L～50.0 μmol/L范围内线性关系良好。
2.4 干扰实验 以浓度为12.9 μmol/L的HCY为基础血清，加入不同浓度的干扰物，结果表明，血氨<50.0 μmol/L，三酰甘油<11.0 mmol/L，抗坏血酸<10.0 mmol/L，胆红素<500.0 μmol/L，血红蛋白<2.0 g/L，谷胱甘肽<0.05 mmol/L时，偏差均<5.0%，说明上述浓度的物质无明显干扰。
2.5 方法比较 选择HCY浓度在3.8 μmol/L～88.0 μmol/L的临床血浆标本40份，分别用本法(Y)和高效液相色谱法(X)测定，每份样品作双份测定，结果取均值，按NCCLS EP9P文件的评价方案统计结果：X=22.9 μmol/L，Y=24.1 μmol/L，Y=0.972X+1.595，R2=0.973 7。配对t检验得：t=2.01，P>0.05，两者差异无显著性。
2.6 参考值范围 选用120名体检结果正常、肝肾功能试验等各项理化指标正常的献血者的空腹血浆标本，年龄在22岁～45岁之间，其中，男68例，女52例。男性参考值：(11.74±4.08)μmol/L;女性参考值：(8.96±3.11)μmol/L。与文献报道正常人血浆HCY浓度相符[4]。
3 讨论
HCY为含巯基氨基酸，是胱硫醚和蛋氨酸转硫化和甲基化代谢旁路中形成的中间体。80%的同型半胱氨酸在血中通过二硫键与蛋白质结合，只有很少一小部分游离同型半胱氨酸参加循环。自20世纪60年代初在尿中首次被发现以来，同型半胱氨酸被认为与多种先天性代谢缺限有关，如胱硫醚β合成酶缺乏是已知的造成高同型半胱氨酸尿症的原因。最近，人们又发现高同型半胱氨酸血症是发生外周血管、脑血管和冠状动脉血管疾病的危险因素之一，同型半胱氨酸不仅可影响脂类代谢，还可通过多种其他途径诱发心血管疾病。据调查，相当大比例的人群面临高同型半胱氨酸血症的危险，尤其是当食物中叶酸和维生素B12摄入不足时更是如此。这些说明，遗传因素、环境因素、叶酸及维生素B12摄取量都与同型半胱氨酸血症有关[5，6]。
血浆同型半胱氨酸浓度测定近年来受到广泛重视，临床上可作为硬化性心血管疾病的危险指标，同型半胱氨酸浓度升高的程度与疾病的危险性成正比。测定同型半胱氨酸的常用方法是高效液相色谱(HPLC)，对还原型同型半胱氨酸的荧光衍生物或使用电化学检测器直接测量。目前，同型半胱氨酸的测定方法还有荧光偏振免疫分析(FPIA)和酶联免疫吸附实验(ELISA)。本实验是通过特异性的HCY甲基转移酶和S腺苷同型半胱氨酸水解酶催化同型半胱氨酸转变为S腺苷同型半胱氨酸，S腺苷同型半胱氨酸再水解生成同型半胱氨酸，使反应循环进行，信号不断放大。循环酶法与最常用的HPLC法比较，适合在多种自动化分析仪上测定，不需特殊的设备，省却了检测前荧光衍生，消除了由于衍生而造成的误差，操作简便，灵敏度高，线性范围宽，抗干扰因素强，精密度较好，可以满足大批量标本的同时自动化分析。由于目前自动化分析仪在国内大多数医院已经普及，所以循环酶法测定HCY是一种值得推广的方法。
【参考文献】
[1] 陈健，张金枝，程龙献.高同型半胱胺酸血症:心脑血管疾病的独立危险因子[J].血管康复医学杂志，2000，9:2.
[2] Ueland PM,Refsum H,Stabler SP,et al.Total homocysteine in plasma or serum：methods and clinical applications[J].Clin Chem,1993,39：17641779.
[3] 郭健，肖飞.高效液相色谱法测定血浆同型半胱氨酸[J].中华医学检验杂志，2000，23：217219.
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[5] 季福绥，范海荣,孙福成，等.老年人亚甲基四氢叶酸还原酶、蛋氨酸合成酶基因多态性及同型半胱氨酸水平与冠心病的关系[J].中华老年医学杂志，2004，23(6)：376379.
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