阿霉素对K562细胞Gfi1表达的影响及其与相关凋亡基因关系

　　作者：常伟　,孙汉英　,黄敏　,周剑锋　　　作者单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院血液科，武汉 430030

　　【摘要】本研究探讨阿霉素体外作用于K562细胞的细胞效应及癌基因Gfi1和相关凋亡基因表达变化的机制。用不同浓度的阿霉素作用于K562细胞24小时,然后应用DNA电泳和流式细胞术检测K562细胞凋亡;用RTPCR、流式细胞术检测Gfi1、Bcl2、bax 基因和蛋白表达的变化。结果表明：当阿霉素浓度在0、0.5、2.0 mg/L作用K562 细胞24小时,细胞凋亡增加,可见典型的DNA断裂电泳条带;同时,当ADM浓度自0.5增为2.0 mg/L时, Gfi1表达减少,bax表达增加;Bcl2表达在ADM 0.5-2.0 mg/L之间变化不明显,mRNA及蛋白水平均无统计学差异;当阿霉素浓度大于2.0 mg/L时,细胞凋亡率并不增加,而是下降,且出现细胞坏死。结论：　一定浓度阿霉素能诱导K562 细胞凋亡,细胞凋亡率表达的变化与阿霉素浓度呈一定的量效依赖关系, 阿霉素诱导K562 细胞凋亡可能与抑制Gfi1基因的表达和激活bax 基因的表达有一定的关系。

　　【关键词】 阿霉素,K562 细胞,细胞凋亡,Gfi1; Bcl  2; 　bax

　　Abstract The study was purposed to explore the effect of adriamycin (ADM) on K562 cells in vitro and the mechanism of expression changes of relevant apoptotic genes and oncogene Gfi1.　The apoptosis was assayed by flow cytometry (FCM) and the DNA electrophoresis; the expression changes of Gfi1、Bcl2、bax mRNA and protein were detected by RTPCR and FCM after K562 cells were treated with different concentrations of ADM for 24 hours. The results showed that when K562 cells were treated with 0-2.0 mg/L ADM for 24 hours, the typical apoptotic DNA electrophoresis band of K562 cells were observed with the dose increasing. When concentration of ADM was 0.5 and 2.0 mg/L, the expression of Gfi1 decreased and the expression of bax increased; when concentration of ADM was 0.5-2.0 mg/L, the expression of Bcl2 was not found to be significantly changed, the levels of Bcl2 mRNA and protein were of no statistical difference. When dose of ADM was higher than 2.0 mg/L, the percentage of apoptotic K562 cells decreased with cell necrosis. It is concluded that at certain range of concentration, apoptosis or necrosis of K562 cells can be induced by ADM, the percentage of apoptosis, the changes of expression of Bcl2, bax and Gfi1 depend on the dose of ADM. The mechanism of apoptosis in K562 cells induced by ADM may be related to suppression of Gfi1 oncogene and activation of expression of bax gene.

　　Key words ADM; K562; apoptosis; Gfi1; Bcl2; bax

　　阿霉素(adriamycin, ADM)在细胞凋亡中起着重要的作用,国内外有不少学者利用阿霉素成功地诱导了细胞凋亡，但对其作用机制还不完全清楚。为此,我们利用阿霉素诱导急性髓系白血病细胞株K562细胞凋亡,旨在了解阿霉素对细胞凋亡的作用机制,为今后临床血液系统肿瘤的治疗提供理论的依据。

　　材料和方法

　　试剂和细胞系

　　K562细胞由我院免疫学教研室提供,胎牛血清为杭州四季青公司产品, 阿霉素购自意大利Pharmacia 公司(批号：215002),RPMI 1640 购于美国Gibco公司, 碘化丙锭(PI)购于北京中山生物工程公司。AnnexinV/PI试剂盒购自北京宝赛生物工程公司。RTPCR试剂盒购自华美公司。羊抗多克隆Gfi1、羊抗多克隆Bcl2、鼠抗单克隆bax购自美国Santa Cruz公司。兔抗羊及兔抗鼠FITC标记二抗购自北京中山生物工程公司。

　　中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(2)阿霉素对K562细胞Gfi1表达的影响及其与相关凋亡基因的研究细胞培养

　　K562 细胞培养于含有10%的胎牛血清的RPMI 1640 液中,在含5 % CO2饱和湿度的培养箱中常规传代培养。每2天进行半量传代。取对数期生长细胞,调整K562 细胞浓度至(2-5)×105/ml,接种于6孔的培养板,每孔加入2 ml细胞液,然后分别加入阿霉素的终浓度为0,0.1,0.2,0.5,1.0,2.0及5.0 mg/L，每个浓度取3个平行孔。每次实验重复3次。

　　DNA提取及电泳

　　以0 mg/L为对照组，0.5 mg/L、 2.0 mg/L的阿霉素作用于K562细胞24 小时后, 收集细胞1×106, 常规方法提取DNA , 溶于200 μl 1×TE。取12 μl 样品1%琼脂糖凝胶电泳约50分钟, EB染色, 紫外灯下观察并照相。

　　细胞凋亡的FCM检测

　　采用AnnexinVFITC/PI双染法FCM检测，方法参照试剂盒说明书进行。取上述终浓度处理细胞24 小时,分别收集106 以上的细胞于离心管中,用PBS 充分洗涤,沉淀，加100 μl binding buffer,重悬细胞，然后加入AnnexinV 5 μl和PI 2 μl, 4℃避光30分钟;再加400 μl binding buffer,上FCM分析。

　　Gfi1、Bcl  2、Bax 蛋白水平变化的FCM检测

　　以0 mg/L为对照组，0.5、 2.0 mg/L的阿霉素作用于K562细胞24 小时后, 收集细胞1×106，75%乙醇固定细胞48小时，0.1%Triton100破膜，Gfi1和Bcl2、bax抗体(1∶100)37℃避光孵育60分钟， FITC标记二抗(1∶200)37℃避光孵育60分钟，上机检测，分别用无关IgG作一抗对照; PBS+二抗作二抗对照。

　　Gfi1、Bcl  2、bax 基因表达水平的RTPCR检测

　　以0.5、2.0 mg/L 阿霉素作用于K562 细胞24 小时，按TRIZOL试剂盒的使用说明提取各自总的RNA,用AMV逆转录试剂盒合成cDNA，在20 μl总反应体系中含3 μl总RNA，42℃孵育1小时，65℃灭活5分钟, -20℃保存。引物根据Primer 5.0 软件设计,由博亚生物公司合成： Gfi1：sense:5'GCAAGGCATTCAGCCAGAG 3'， antisense:5'AAGGCAAAGGAGGAGCAA3'，Tm=55℃,产物308 bp;Bcl2：sense 5'TCTGGGAATCGATCTGGA  3'，antisense 5'ATCTCCCGGTTATCGTA3'，产物304 bp, Tm=44℃;bax：sense:5'GGCTGGACATTGGACTT3，antisense5'CCCGAAGGAGGTTTATT3'，产物538 bp, Tm=46℃;βactin：sense:5' CTCACGAAACTGGAATAAGC 3'， antisense:5' AAGCCACACGTACTAAAGGT 3' , Tm=55℃，产物180 bp。按RT  PCR 试剂盒在PCR 仪上扩增,其循环参数为50℃，30 分钟，95℃，15分钟,激活耐热DNA 聚合酶, 进行逆转录成cDNA; PCR反应参数为94℃ 45秒, Tm ℃ 45秒,72℃ 45秒,32个循环,最后72℃ 10分钟;获得产物用1.5 %琼脂糖凝胶电泳。 RTPCR结果用Quantscan软件进行半定量灰度扫描分析。在各样本之间灰度值与βactin灰度值比值相比较。

　　统计学分析

　　实验数据以均数±标准差(±SD)表示,所有数据采用SPSS 11.5医学统计学软件处理。组间差异比较按单因素方差分析F检验。

　　结 果

　　DNA凝胶电泳

　　2.0 mg/L的阿霉素可使K562细胞出现典型的DNA 电泳条带, 即DNA ladder(梯状DNA 条带), 断裂的DNA 片段约为180 bp或其整数倍。而0.5 mg/L的阿霉素作用后K562细胞则无此DNA 断裂现象。

　　不同浓度阿霉素对K562细胞凋亡的作用

　　0.1-2.0 mg/L阿霉素处理K562细胞24小时细胞凋亡增加,2.0 mg/L时凋亡率最高(图2)。当大于2.0 mg/L时,细胞凋亡率反而降低。

　　Gfi1 、Bcl2、bax基因表达在阿霉素处理前后的变化

　　用0.5 mg/L , 2.0 mg/L处理后的细胞, Gfi1的条带逐渐变得模糊,灰度扫描结果比值统计检测P<0.05, 差异有显著性,说明Gfi1基因表达在阿霉素浓度在2.0 mg/L表达减少。bax条带变得清晰,灰度扫描结果比值统计检测P<0.01,差异有显著性,表明bax基因表达在阿霉素浓度2.0 mg/L增加。Bcl2条带变化在0.5 mg/L, 2.0 mg/L时不明显,灰度扫描结果比值统计检测P﹥0.05,差异无显著性,表明Bcl  2基因表达在阿霉素浓度在0.5与2.0 mg/L两个浓度下变化不大。

　　结果显示, 用0.5 mg/L, 2.0 mg/L处理后的细胞, Gfi1的平均荧光强度减弱,均值统计检测P<0.05,差异有显著性,说明Gfi1蛋白表达在阿霉素浓度在0.5-2.0 mg/L范围内随浓度增加而减少。bax平均荧光强度逐渐变强，均值统计检测P<0.01,差异有显著性,表明bax蛋白表达在阿霉素在

　　0.5-2.0 mg/L范围内随浓度增加而增加。Bcl2平均荧光强度在0.5 mg/L, 2.0 mg/L时均值统计检测P﹥0.05,差异无显著性,表明Bcl2蛋白表达在0.5-2.0 mg/L 范围内随浓度增加变化不大。

　　讨 论

　　尽管目前已对许多肿瘤药物的靶细胞有了一定了解，但对于药物与肿瘤作用如何导致细胞死亡的确切机制仍不十分清楚。现在已经证实，愈来愈多的化疗药物可引起肿瘤细胞凋亡[1]，因此诱导凋亡将是筛选抗肿瘤药物的重要方向，也是评价药物疗效的可靠指标。阿霉素是通过嵌入DNA相邻碱基对，抑制模板活性，迷失DNA链裂解而发挥抗肿瘤作用。

　　我们的研究提示,在体外用一定浓度的阿霉素作用于K562 细胞24小时,通过DNA电泳、流式细胞仪检测显示：阿霉素能诱导K562 细胞凋亡,在0.1-2.0 mg/ L ,随着阿霉素浓度的增加,凋亡率也随之升高,在2.0 mg/ L,凋亡率最高,但当再进一步升高其浓度时,凋亡率并无明显增加,而出现细胞坏死,提示高浓度的阿霉素能引起细胞坏死。

　　Gfi1的癌基因潜能是在1个大鼠T细胞淋巴瘤的MOMULV的整合位点中发现的[11]。在Gfi1敲除鼠和中性粒细胞减少的患者中出现了髓系表达的异常的相同表型，说明Gfi1在中性粒细胞发育中是一个关键性的调节因子[9，10]。缺乏Gfi1的鼠发生中性粒细胞减少[6]。在这些鼠中成熟的中性粒细胞缺乏并且它们的髓系前体细胞在粒细胞集落刺激因子(GCSF)的治疗下也不能分化成成熟的粒细胞。有着不成熟的粒细胞、单核巨噬细胞前体细胞特征的不典型的Gr1+Mac1+细胞在这些鼠的骨髓中集聚，在筛选的缺乏Gfi1的前体细胞中，使其再表达Gfi1，通过GCSF的治疗，其能够向中性粒细胞进一步分化。以上的研究强烈提示了Gfi1在中性粒细胞分化中的实质作用。

　　本实验通过RTPCR检测发现,在0.5、2.0 mg/L浓度时,随着阿霉素浓度的增加, Gfi1的表达减少,与阿霉素的浓度呈反比关系。这说明阿霉素诱导细胞凋亡的过程中, Gfi1的表达减少。

　　有研究结果显示，肿瘤细胞对化疗药物敏感或耐受在一定程度上取决于凋亡相关基因的表达状态[2]。导致细胞凋亡主要通过两条途径:线粒体途径( 内部的) 和死亡受体途径( 外部的) , 线粒体是bcl2基因蛋白和bax基因蛋白在细胞内的主要分布部位。bcl2基因家族与线粒体调控细胞凋亡中的作用密切相关[3]。研究表明，Bcl2和Bax的比值，很大程度上决定细胞存活或凋亡[4]。本实验通过RTPCR检测发现,在阿霉素浓度为0.5 mg/L时，Bcl2的表达减少, 但在2.0 mg/L时与0.5 mg/L浓度相比，Bcl2的表达减少变化不大。Bax的表达则增加,在0和0.5与 2.0 mg/L的范围内呈正比关系。这说明阿霉素诱导细胞凋亡的过程中,能使促凋亡基因Bcl2表达减少,而使Bax 表达增加。Bcl2/Bax的比值减小，促使细胞发生凋亡。Bcl2 还能作用于Bcl2家族的其它成员,尤其是促凋亡蛋白,如通过抑制Bax在线粒体的定位和寡聚化而抵消Bax 的促凋亡作用。

　　Grimes等[7]研究表明，在Gfi1能使IL2依赖细胞系逃避IL2去除所诱导的G1期阻滞。其原因主要是Gfi1癌蛋白直接抑制了Bax的表达[8]。Bax的启动子包含了几个有着AATC或AAGC核的Gfi1连接位点，CMV5Gfi1表达载体的共转染抑制了Bax/CAT的结构，包含了1个AATC核的Gfi1连接位点突变成TTTC诱导了Gfi1对Bax的抑制，然而包含了AATC和AAGC核的Gfi1连接位点突变成TTTC和TTGC却去除了Gfi1所诱导的抑制。

　　而本实验Bcl  2、Gfi1、bax基因的表达变化表明: Bcl  2、Gfi1、bax在阿霉素诱导的凋亡中起着一定的调节作用。当Gfi1对bax的抑制作用解除后，细胞中bax的含量明显高于Bcl2，Bax/Bcl2比值升高，使bax不仅能与Bcl2形成异源二聚体抑制细胞凋亡，而且其自身还能形成同源二聚体诱导凋亡[5]。

　　本实验的结果可以说明，bcl2、Gfi1、bax基因等改变有可能作为体外肿瘤化疗药敏检测的辅助指标或用于判断临床预后。据此提示, 临床上可运用Gfi1的反义寡核苷酸等技术阻断Gfi1的表达, 以提高肿瘤的化疗敏感性。

　　【参考文献】

　　1Kawanishi S, Hiraku Y. Amplification of anticancer druginduced DNA damage and apoptosis by DNAbinding compounds. Curr Med Chem Anti Canc Agents, 2004; 4:415-419

　　2Beurel E, Kornprobst M, BlivetVan Eggelpoel MJ, et al. GSK3beta inhibition by lithium confers resistance to chemotherapyinduced apoptosis through the repression of CD95(Fas/APO1) expression. Exp Cell Res, 2004; 300:354-364

　　3周永列,吕亚萍,邱莲女等. 硝普钠诱导K562细胞凋亡机制的研究. 中国实验血液学杂志, 2005 ;13: 983-988

　　4Raisova M, Hossini AM, Eberle J, et al. The Bax/Bcl2 ratio determines the susceptibility of human melanoma cells to CD95/Fasmediated apoptosis. J Invest Dermatol, 2001; 117:333-340

　　5Han J, Goldstein LA, Gastman BR, et al. Differential involvement of Bax and Bak in TRALmediated apoptosis of leukemic T cells. Leukemia, 2004; 18:1671-1680

　　6Hock H, Hamblen MJ, Rooke HM, et al. Intrinsic requirement for zinc finger transcription factor Gfi1 in neutrophil differentiation. Immunity, 2003;18:109-120

　　7Grimes HL, Chan TO, ZweidlerMcKay PA, et al. The Gfi1 protooncoprotein contains a novel transcriptional repressor domain, SNAG, and inhibits G1 arrest induced by interleukin2 withdrawal. Mol Cell Bio, 1996; 16:6263-6272

　　8Grimes HL, Gilks CB, Chan TO, et al. The Gfi1 protooncoprotein represses Bax expression and inhibite Tcell death. Proc Natl Acad Sci USA, 1996; 93:14569-14573

　　9Karsunky H, Zeng H, Schmidt T, et al. Inflammatory reactions and severe neutropenia in mice lacking the transcriptional repressor Gfi1. Nat Genet，2002; 30:295-300

　　10Gilks CB, Bear SE, Grimes HL, et al. Progression of interleukin2(IL2)dependent rat T cell lymphoma lines to IL2independent growth following activation of a gene (Gfi1) encoding a novel zinc finger protein. Mol Cell Biol, 1993; 13:1759-1768