海藻糖负载红细胞及其冻干保存研究

　　作者：陈燕,陆志刚,韩颖　　作者单位：南方医科大学珠江医院输血科，广州 510282

　　【摘要】为了研究海藻糖负载红细胞方法的可行性及红细胞内海藻糖对冻干红细胞的影响，利用红细胞膜在37℃时细胞膜上部分脂质由固态变为液态、流动性增大和膜通透性增加的性质，将红细胞置于高浓度海藻糖负载液中孵育7小时，并以磷酸缓冲盐溶液中孵育的红细胞作为对照，对红细胞的海藻糖负载率、形态学、渗透脆性、变形性、ATP含量及2，3-DPG含量进行评价。结果表明： 负载后红细胞内海藻糖含量为36.56±7.95 mmol/L，实验组红细胞溶血率为(15.663±3.848)%，对照组红细胞溶血率为(5.03±1.85)%，差异显著(P﹤0.05);实验组红细胞变形指数是0.0289±0.00738，对照组红细胞变形指数是0.1200±0.0121，差异显著 (P﹤0.05);负载后实验组红细胞内ATP含量为2.67±0.54 μmol/gHb，对照组红细胞内ATP含量为5.22±1.10 μmol/gHb(P﹥0.05)，实验组 红细胞渗透脆性降低，明显低于对照组。尽管负载组的红细胞大小不一，形态各异，但在透射电镜下绝大多数红细胞膜完整，胞内血红蛋白密度均匀，而对照组有近一半的细胞膜不完整并有漏孔，胞内血红蛋白密度变浅。实验组与对照组中2，3-DPG含量均为零。实验组红细胞冻干再水化后，血红蛋白回收率46.44±4.14%，对照组血红蛋白回收率8.33±2.34%，差异显著(P﹤0.001)。结论： 海藻糖负载的红细胞功能符合输注标准，负载方法可行，负载入细胞内的海藻糖能够保持细胞膜的完整性，大大提高了冻干红细胞的回收率，为红细胞的冷冻干燥成功迈出了第一步。

　　【关键词】 海藻糖

　　Abstract This study was aimed to investigate the feasibility of cryopreserving red blood cells (RBCs) by loading with trehalose and to evaluate the effect of trehalose on lyophilized RBCs. Based on the thermal properties of RBC plasma membrane，the RBCs were incubated in 0.8 mol/L trehalose solution at 37℃ for 7 hours，and RBCs incubated in phosphate-buffered saline were used as control. The morphology of RBCs was observed by light and scaning eleetron microscopy，the hemolysis rate of loaded RBCs was detected by using cyanohemoglobin kit，the intracellular trehalose levels were assayed by sulfate anthrone method，the intracellular ATP and 2，3-DPG levels were determined by bioluminescence assay and 2，3-DPG kit respectively，meanwhile the deformation and osmosic fragility of RBCs were measured. The results showed that the intracellular trehalose concentration was 36.56±7.95 mmol/L，the electronical microscopic images of trehalose-loaded RBCs showed the membrane integrity，the hemolysis rate in trehalose-loaded RBCs was 15.663±3.848%，while hemolysis rate in controled RBC was 5.03±1.85% (P﹤0.05). Maximum index of deformation in trehalose-loaded RBC was 0.0289±0.00738，while maximum index of deformation in control group was 0.1200±0.0121 (P﹤0.05)，The level of ATP in trehalose-loaded RBC was 2.67±0.54 μmol/gHb，while the level of ATP in control group was 5.22±1.10 μmol/gHb(P﹥0.05). Osmotic fragility data showed that trehalose exerted osmotic protection on RBC. During loading period the level of 2，3-DPG in trehalose-loaded RBC was maintained close to the level in control. When trehalose-loaded RBCs were lyophilized and rehydrated，the recovery rate of hemoglobin was about 46.44±4.14% and that in control was 8.33±2.34% (P﹤0.001). The recovery rate of hemoglobin of trehalose-loaded RBC was higer than that of control. It is concluded that trehalose can be integrated in the membrane of RBC in lyophilization state，maintain the integrity of RBC membrome，and significantly enhance the recovery rate of hemoglobin of cryopreveserved RBCs. Cryopreserving RBCs by loading with trehalose is feasible.

　　Key words trehalose; red blood cell; freeze-drying preservation

　　冷冻干燥方法是保存红细胞最理想的方法，因为冻干的红细胞具有能在常温下保存，而且性能稳定、保存时间长、便于运输及保存费用低廉等优势，克服了目前红细胞保存的局限性[1]。然而，红细胞在冻干过程中要经历低温和干燥的损伤，红细胞膜破损、血红蛋白外漏和细胞功能的降低。如何防止红细胞在冻干过程中膜的破损，是红细胞冻干保存成功的重要一步。海藻糖是低温研究领域最佳的保护剂，在低温和干燥状况下，能维持生物膜的完整性。但海藻糖只有分布于细胞膜两侧，且细胞内的海藻糖达到100 mmol/L时，才能在冻干过程中保护细胞膜的完整性[2]。海藻糖是葡萄糖的二聚体，一般情况下，不能透过细胞膜。如何将海藻糖导入细胞内，对低温工作者是一个重大的挑战。我们利用红细胞膜上部分磷脂在37℃时由固态变为液态，细胞膜的流动性增加和细胞通透性升高的性质，将红细胞置于0.8 mol/L海藻糖负载液中，在37℃恒温水浴锅中孵育7小时[3]，然后评价红细胞各项功能指标及冻干后血红蛋白的回收率，以明确细胞内海藻糖在红细胞冻干过程中的作用。

　　材料和方法

　　试剂

　　海藻糖、蒽酮、羟乙基淀粉(高分子量)、聚乙烯吡咯烷酮(平均分子量40 000)购自美国Sigma公司。三氯乙酸、浓硫酸(分析纯)购自北京化工厂。氰化血红蛋白试剂盒购自北京天来生物公司。ATP荧光素酶-荧光素粉剂为中国科学院上海植物生理研究所产品。2，3-DPG试剂盒购自罗氏公司。20%人血白蛋白为哈尔滨世纪亨氏公司生产。

　　仪器

　　MP4R低温离心机(IEC，USA产品)、723型分光光度计(上海第三仪器厂产品)、MINILYO45冷冻干燥机(Usifroid，France产品)、深低温冰箱(Sanyo，Japan产品)，BH2-RFL型光学显微镜(日本Olympus公司产品)，CM120型透射电镜(荷兰Philips公司产品)、LG-B-190血细胞变形仪(中国北京世帝公司产品)、WDD-1型发光光度计(北京第二光学仪器厂产品)。

　　实验方法

　　海藻糖负载红细胞

　　从解放军307医院取3人份新鲜全血，在4℃条件下，以329×g离心14分钟，弃上清及灰白层(血小板及白细胞);用等量PBS液清洗3遍，用530×g离心10分钟，弃上清，制成浓集红细胞。用0.8 mol/L海藻糖负载液负载红细胞，浓集红细胞与海藻糖负载液以1∶3体积比混匀，对照组用等渗的PBS负载红细胞。每个样品在37℃恒温水浴锅中孵育7小时[3]。

　　海藻糖负载的红细胞和对照组红细胞的形态观察

　　在BH2-RFL型光学显微镜及CM120型透射电镜下观察负载红细胞的形态变化。

　　负载样品的溶血率测定

　　用氰化血红蛋白试剂盒测定负载样品的吸光值，以1 528×g离心10分钟，测定上清的吸光值。溶血率=(上清吸光值/负载样品的吸光值)×100%。

　　细胞内海藻糖量的硫酸-蒽酮法测定

　　负载后的红细胞离心弃上清，用等渗的PBS清洗3遍，加入3倍体积的10%的三氯乙酸混匀，萃取45分钟，共2次，离心后收集上清[4]。取上清1 ml，加入浓度为2%的硫酸-蒽酮溶液4 ml，煮沸10分钟，自然冷却至室温，在620 nm波长下测定各样品吸光值。配制不同浓度的海藻糖标准溶液，绘制标准曲线，计算拟合方程，用拟和方程求出各样品的海藻糖含量，用温氏法[5]测定所萃取红细胞的压积，计算红细胞内海藻糖的浓度。

　　海藻糖负载红细胞的变形性测定

　　吸取负载后的浓集红细胞40 μl与15%聚乙烯吡咯烷酮800 μl混匀，在LG-B-1900细胞变形仪下，采用1 000应切力，测定红细胞变形性。

　　海藻糖负载红细胞渗透脆性测定

　　用红细胞温育渗透脆性实验测定负载红细胞的渗透脆性[6]。

　　海藻糖负载红细胞内的ATP含量测定

　　用生物发光法测定负载红细胞内ATP含量[7]。

　　海藻糖负载红细胞的2，3-DPG含量测定

　　用罗氏公司2，3-DPG试剂盒测，具体操作按试剂盒的说明书进行。

　　海藻糖负载红细胞的冰冻干燥保存

　　取0.25 ml负载的浓集红细胞，加入0.75 ml冻干保护液(15%高分子量的HES，2.5%的人血白蛋白)[8]，在-80℃深低温冰箱中预冻24小时，将样品快速移入冻干机内，冰冻干燥处理24小时，冻干机搁板温度设定为-35℃，冷阱温度-50℃，真空压力小于200 mbar。冻干结束后，用37℃的6%羟乙基淀粉快速水化样品[9]。水化后，将样品混匀，取20 μl，用氰化血红蛋白试剂盒测定样品的总血红蛋白量，然后将样品以1 528×g离心20分钟，用氰化血红蛋白试剂盒测定上清游离血红蛋白量。冻干再水化后的红细胞血红蛋白回收率=(样品总血红蛋白-样品游离血红蛋白/样品总血红蛋白) ×100% 。

　　数据处理

　　用SPSS软件处理数据，实验结果用均值±标准差(x±SD)表示，实验组与对照组之间的差异显著性用配对t检验。

　　结果

　　形态学

　　光学显微镜下海藻糖负载的红细胞大小不一，形态各异，有圆盘状、球形及多棘突细胞。对照组细胞大多数为双面凹形的圆盘状细胞。透射电镜下海藻糖负载的红细胞大小不一，形态各异，但海藻糖负载的细胞胞膜光滑，完整，胞内血红蛋白分布均匀，偶可见网格状细胞。对照组细胞形态规整，有近一半细胞膜不完整，有漏孔，胞内血红蛋白密度变浅(图1、2)。

　　溶血率

　　溶血率是反映红细胞损伤程度的一个重要指标，溶血率的高低，反映了细胞的破坏程度。在0.8 mol/L的海藻糖的负载液中，红细胞负载7小时，溶血率为15.663±3.848，而在等渗的PBS缓冲液中，孵育7小时，溶血率为5.03±1.847(P﹤0.05)

　　海藻糖负载红细胞内海藻糖浓度

　　经海藻糖负载的红细胞，细胞内的海藻糖浓度为36.56±7.95 mmol/L，在PBS孵育液中，糖浓度是0.03±0.004 mmol/L(P﹤0.001)。红细胞来自9个健康献血者，27个样本 。真正负载入红细胞内海藻糖的浓度是海藻糖负载组内的糖浓度减去对照组中红细胞内的糖浓度。

　　红细胞变形性

　　新鲜红细胞最大变形指数是0.4429±0.0510，红细胞在37℃条件下，孵育7小时，细胞的变形性均下降，海藻糖负载组红细胞的变形指数是0.0289±0.00738，PBS孵育组红细胞的变形指数是0.1200±0.0121 (P﹤0.05)。

　　红细胞渗透脆性

　　海藻糖负载组红细胞50%溶血率的氯化钠的浓度为51.3-55.8 mmol/L，经PBS孵育的红细胞50%溶血率的氯化钠的浓度为80-82.5 mmol/L。数据显示，海藻糖负载的红细胞渗透脆性低于对照组，证明海藻糖增强了红细胞的渗透耐受性。

　　红细胞ATP含量

　　海藻糖负载组红细胞内ATP的水平是2.67±0.54 μmol/gHb，而对照组ATP的水平是5.22±1.10 μmol/gHb。尽管对照组红细胞内ATP的水平高于实验组，但两者ATP的水平均大于1.5 μmol/gHb。 1.5 μmol/gHb的ATP含量是保证红细胞输注后24小时存活率不低于70%的临界指标[7]。

　　红细胞2，3-DPG含量

　　新鲜红细胞2，3-DPG含量为2.22±0.18 μmol/gHb，在温度为37℃，孵育7小时后，实验组和对照组的红细胞中2，3-DPG的水平均下降为零(样品来自3个健康献血者，9个标本)。

　　冻干红细胞再水化后血红蛋白回收率

　　红细胞冻干再水化后，海藻负载组血红蛋白的回收率为(46.44±4.14)%，而对照组红细胞血红蛋白的回收率为(8.33±2.33)%(P﹤0.001)。

　　讨论

　　红细胞的冰冻干燥保存研究从上世纪60年代开始，已历经30多年，但未取得突破性的进展。长期以来，一直无法解决冻干过程中红细胞膜破损、血红蛋白外漏、红细胞携氧功能丧失的难题。研究者们从抗低温和耐干旱植物体内有大量海藻糖积累得到了启示，对海藻糖的作用进行了深入研究[9，10]。大量的实验证明，海藻糖在干燥条件下有稳定生物膜的作用[11]。海藻糖只有分布于生物膜的两侧才能发挥保护作用。二糖一般不能透过细胞膜，将二糖导入细胞内是对研究细胞和器官低温保存的研究者们的二个巨大的挑战。研究者采用生物内吞法[12]、生物打空法[13]、电穿孔法[14]、基因工程法[15]、膜相变原理[16]等将海藻糖导入哺乳动物细胞内。我们利用37℃时细胞膜相变和细胞通透性增加的性质，将红细胞置于高浓度的海藻糖负载液中，使海藻糖顺浓度差进入了红细胞内。

　　Satpathy等[3]对红细胞负载海藻糖技术已进行了研究，实验得出的最佳负载条件是将红细胞置于0.8 mol/L海藻糖负载液中，在37℃下负载7小时。本实验旨在评估此条件下海藻糖负载率及负载红细胞各方面的功能。同时通过对负载红细胞冻干的研究，以明确细胞内的海藻糖对红细胞的冻干保护作用 。我们在实验中对红细胞的溶血率、变形性、红细胞的渗透脆性、ATP含量、 2，3-DPG含量及冻干后的血红蛋白回收率等6方面作了评价。尽管负载过程中海藻糖负载组的溶血率高于对照组(P﹤0.05)，变形性低于对照组(P﹤0.05)，但海藻糖负载组红细胞的生物能量(ATP)与对照组无差异(P﹥0.1)，红细胞内ATP含量与红细胞膜的完整性、变形能力、体积和密度密切相关，同时与输注后红细胞24小时的生存率有极为显著的相关性[7]。可以推断，负载海藻糖的红细胞功能符合红细胞输注的标准。海藻糖负载组的红细胞，在透射电镜下红细胞的细胞膜光滑、完整，细胞内血红蛋白的密度均匀，未变浅。对照组大部分细胞胞膜不完整，有漏孔，胞内血红蛋白密度变浅。由此可以推断，海藻糖有保护细胞膜完整的功能。在渗透脆性方面，海藻糖负载组红细胞的渗透脆性低于对照组，拓宽了红细胞所能适应的渗透压变化范围。海藻糖负载组的红细胞经冻干、再水化后血红蛋白回收率远远高于对照组(P﹤0.001)，表现出细胞内海藻糖抗干燥和低温损伤的能力。2，3-DPG是红细胞在组织中释放氧能力的一个重要指标。我们在实验中对孵育7小时的红细胞进行了检测，无论是对照组还是实验组，2，3-DPG的含量几乎为零。但2，3-DPG是红细胞能量代谢过程中的一个中间代谢产物，只要有红细胞的能量代谢，就有2，3-DPG的产生。红细胞保存的研究证明，2，3-DPG的含量在红细胞输注人体后进行正常代谢时可逐步得到恢复。

　　总之，此实验验证了海藻糖负载红细胞方法的可行性，经海藻糖负载的红细胞增强了抗干旱和低温的能力，为红细胞的冰冻干燥保存奠定了良好基础。但是，改进负载方法，降低负载过程中红细胞的溶血率，提高海藻糖的负载率，提高红细胞冻干回收率，仍然是今后实验研究的课题。

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　　15Guo N，Puhlev I，Brown DR，et al. Trehalose expression confers desiccation tolerance on human cells，Nat Biotechnol，2000;18:168-171

　　16Garcia-de-Castro A，Tunnacliffe A. Intracellular trehalose improves osmotolerance but not desiccation ttolerance in mammalian cells. FEBS Lett，2000; 487:199-202