rhGCSF对小鼠骨髓间充质干细胞的动员作用

　　作者：刘岐焕,程范军,陈龙,唐俊明1,王家宁1　　作者单位：郧阳医学院附属东风医院血液科，十堰442008

　　【摘要】为了研究rhGCSF体内应用对小鼠骨髓间充质干细胞(MSC)的动员作用，将30只小鼠随机分为2组：rhGCSF组和对照组，分别给予皮下注射rhGCSF 80 μg /(kg•d)和等量生理盐水,连续5天，在最后1次注射后分别于6，12和168小时取小鼠骨髓和外周血，以1×106 单个核细胞(MNC)接种于12孔培养板14天，对形成的成纤维细胞集落(CFUF)进行计数，用胰蛋白酶消化后应用流式细胞术测定表面抗原并进行成脂，成骨诱导。结果表明： rhGCSF组骨髓形成的CFUF数均较对照组明显增加(p<0.01)。6小时取材较12小时,168小时取材形成的CFUF数目多(p<0.01)，12小时与168小时CFUF差异无统计学意义。流式细胞术检测骨髓CFUF显示CD34-、CD133-、CD90+、CD105+，骨髓CFUF具有成脂、成骨分化的能力。rhGCSF组6小时取材外周血具有类似骨髓的CFUF，出现的频率为(0.50±0.11)×10-6，与对照组比较差异有显著性(p<0.05)。结论： rhGCSF可使小鼠骨髓间充质干细胞增殖加速，但时间短暂，其高峰在rhGCSF应用5天后的6小时内。rhGCSF对小鼠间充质干细胞也有动员能力，但作用较弱。

　　【关键词】 骨髓间充质干细胞

　　Abstract To evaluate the effects of rhGCSF on mobilization of mesenchymal stem cells (MSCs) of mouse bone marrow at different time point, thirty mice were randomly divided into rhGCSF treatment group and control group. The mice were subcutaneously injected with rhGCSF in a dose of 80 μg/kg or saline for 5 days. The bone marrow and peripheral blood were obtained at time points of 6, 12, 168 hours after final injection of rhGCSF or saline. Bone marrow mononuclear cells (BMMNCs) were seeded at density of 1×106 MNCs onto 12well plate for culture expansion in DMEM supplemented with 10% FBS,and the number of colony forming unit  fibroblast (CFUF) was counted after 14 days. The cells were collected by trypsinization and the surface antigens CD34, CD133, CD90 and CD105 were analyzed by flow cytometry. The multidifferentiation of MSCs were done in the culture condition of inducedadipocyte and osteocyte. Peripheral blood MNCs examination was same as the bone marrow. The results indicated that the number of CFUF of bone marrow in rhGCSF group was more than that in control group (p<0.01)，the number of CFUF in rhGCSF group at 6 hours was more than that at 12 hours and 168 hours, respectively (p<0.01). There was no obvious difference between CFUF at 12 hours and at 168 hours (p>0.05). MSCs were positive for CD90,CD105 and negative for CD34 and CD133. MSCs were found to differentiate into adipocyte and osteocyte in vitro. The CFUF of PBMNCs obtained and cultured in vitro in the same culture conditions could be observed after the rhGCSF injection at 6 hours, but cloning efficiency was(0.50±0.11)×10-6 MNCs and showed statistical difference as compared with control. It is concluded that rhGCSF to mobilize hemopoietic stem cells can be used to induce mouse MSCs in vivo expansion,which showed the peak value within 6 hours after final injection of rhGCSF. rhGCSF have the mini mobilization effect on murine MSCs derived from bone marrow .

　　Key words rhGCSF;bone marrow mesenchymal stem cell;CFUF

　　J Exp Hematol 2007; 15(4):790-794

　　间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)是目前倍受关注的一类具有多向分化潜能的成体干细胞,被看作是细胞和基因治疗的理想种子细胞。在组织工程中要达到较好的修复重建效果，要求所用的细胞的生物学特性未发生剧烈变化且具有足够的细胞数量。如何获得足够数量的初始MSC是利用MSC进行细胞治疗首先应该解决的问题。众所周知，MSC无论在骨髓还是在外周血中的数量均较造血干细胞(HSC)少。GCSF是目前广泛应用的造血干细胞(HSC)/造血祖细胞(HPC)的动员剂。 GCSF在动员HSC/HPC的同时是否也动员了MSC，此问题在目前有争议。本研究旨在通过体内应用GCSF于不同时间培养骨髓和外周血MSC并观察形成的成纤维样细胞集落(CFUF)以探讨GCSF对MSC的动员效果，为临床应用提供实验依据。

　　实验动物及来源

　　健康昆明种2月龄小鼠30只, 雄性, 体重15-25 g,由郧阳医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(鄂)2003-0005;实验动物使用许可证号：SYXK(鄂)2004-0021;实验动物技术上岗证：鄂动资字第421158号。为无特定病原体动物(specific pathogen free animal，SPF)。入选的动物置于恒温、恒湿的安静饲养室内分笼饲养，每笼5只，每日给予我院动物中心配制的标准块料和自来水喂养。

　　主要药品、试剂和仪器

　　rhGCSF为深圳新鹏生物工程有限公司生产，批号: 20040901; DMEM培养基为Gibco公司产品;胎牛血清为Hyclon公司产品;12孔培养板为Orange sicientific公司产品。重组猪胰岛素、地塞米松、维生素C、β磷酸甘油、5%苏丹Ⅳ染色液、5%硝酸银溶液、5%中性红染液及苏木素染液均为Sigma公司产品。流式细胞术试剂：一抗为大鼠抗小鼠CD34、CD90、CD105、CD133单克隆抗体，购自深圳晶美生物公司,二抗为FITC标记的山羊抗大鼠IgG、PE标记的山羊抗大鼠IgG，购自北京中杉生物公司。CO2培养箱为Binder公司产品;倒置相差显微镜(Nikon公司产品);流式细胞仪为Beckman Coluter公司产品。

　　分组与给药方法

　　将30只小鼠随机分为2组,每组15只。rhGCSF动员组:皮下注射rhGCSF 80 μg/(kg•d)，连续5天;对照组给予皮下注射等量生理盐水，连续5天。最后1次注射后6、12、168小时(即每组再随机分为6、12、168小时3个组，每组5只)分别取骨髓和外周血。

　　MSC的分离和培养

　　用10%水合氯醛麻醉小鼠,在无菌状态剖胸直视下取心脏血, 在无菌玻璃小瓶中将心脏血与含20 U/ml肝素钠的10% FBS DMEM培养基充分混匀，制成MNC悬液。然后取双侧股骨、胫骨。用1 ml注射器吸取2% FBSDMEM培养基反复冲洗骨髓腔至骨头变白，用注射器在无菌玻璃小瓶中反复吹打细胞悬液3-5次。计数骨髓和外周血MNC，以1×106/ml分别接种于含10%胎牛血清的DMEM培养液(含青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml)的鼠尾胶包被的12孔板中，放入37℃、 5% CO2饱和湿度培养箱中培养。24小时(外周血48小时)后换液，去除未贴壁细胞，以后每72小时换液。观察集落生长情况。用倒置显微镜逐日观察，连续观察14天。

　　骨髓和外周血CFUF集落形成分析

　　培养14天后用PBS洗冲掉悬浮细胞，10%甲醛固定15分钟，瑞氏姬姆萨染色半小时，蒸馏水冲洗，苏木素复染5-10分钟，蒸馏水冲洗，放入低倍镜下(×40)记数每孔的CFUF个数(不同时间点各5只，每只小鼠骨髓接种6孔，外周血接种6孔)， 计数≥50个成纤维细胞团为1个CFUF集落 。

　　细胞表面标志的流式细胞术检测

　　对未染色的原代形成的CFUF用0.25%的胰蛋白酶消化、离心，沉淀重悬于PBS液中，每次取约2×106个细胞，分别加入抗小鼠CD34、CD133、CD90、CD105抗体，避光孵育20分钟，用PBS 冲洗后加入相应二抗，避光孵育15分钟，用PBS 冲洗，应用小鼠IgG1FITC和小鼠IgG1PE做为同型对照，用流式细胞仪检测抗原的表达情况并分析其所占比例。

　　成骨、成脂肪诱导及鉴定

　　每组取2只将未染色的原代形成的CFUF消化后收集细胞，调整骨髓MNC密度在5×105个/ml，重新接种于12孔板中培养。24小时换液，去除未贴壁的细胞，换液后6孔加入成骨诱导液(15% FBSDMEM,含地塞米松4×10-6 mg/ml、β磷酸甘油1 mg/ml、维生素C 0.5 mg/ml)，6孔加入成脂肪诱导液(15% FBSDMEM,含重组猪胰岛素0.01 mg/ml)。每72小时换液，诱导2周后观察,在诱导出现脂滴和矿物结节后，分别用油红O染色和Von Kossa矿化结节染色法染色。

　　统计学分析

　　实验数据用±SD表示，多个均数比较用单因素方差分析，组内比较采用t检验，组间比较采用q检验，采用SPSS 10.0进行统计分析。

　　结 果

　　细胞形态学观察

　　骨髓MNC接种24小时后，可以见到少量成纤维样细胞贴壁，分散存在，悬浮细胞在换液过程中逐渐被淘汰。培养6天后可见成纤维样细胞集落出现，14天之后集落明显地增大。外周血MNC接种后首次48小时半量换液，此时大量的造血细胞沉积于培养板底，贴壁细胞无法辨认，此后每3天换液1次，14天之后在rhGCSF组有类似骨髓的成纤维细胞样集落出现，其细胞形态比较均一，呈多极状。

　　骨髓和外周血 CFUF集落形成分析

　　rhGCSF组的骨髓CFUF集落数均较对照组CFUF集落数明显增加(p<0.01)。6小时取材较12小时、168小时的CFUF数取材所形成的CFUF数目多(p<0.01)，12小时与168小时取材的比较差异无统计学意义(p>0.05)。rhGCSF组外周血接种6小时之后有CFUF出现，较对照组CFUF数增多，差异有统计学意义(p<0.05)。对照组和rhGCSF组在12小时、168小时未观察到CFUF形成。

　　成骨、成脂肪分化功能的鉴定

　　成骨诱导2周之后CFUF出现矿物结节，Von Kossa染色后观察到大多数的CFUF中心位置出现钙结节。成脂肪诱导2周之后观察到CFUF中(80±7)%的MSC出现脂滴，油红O染色之后可见到CFUF中(85±6)%的细胞胞浆呈红色。外周血形成的CFUF，由于所含的细胞太少而无法进一步诱导。

　　CFUF的表型

　　应用流式细胞仪检测骨髓MNC培养形成的CFUF中的MSC表明，CD34-、CD133-、CD90+、CD105+，分别各占2.5%、3.1%、67%和78%，此结果提示MSC有别于造血干细胞的骨髓非造血干细胞。外周血形成的CFUF,由于所含细胞的数量太少，因而无法应用流式细胞仪检测细胞表面的标记。Figure 5. Phenotype identification of bone marrow derived MSCs. MSCs higher express CD90, CD105, but lower or not express CD34 and CD133.

　　讨 论

　　目前已知骨髓是机体最大的干细胞池，至少包含HSC、MSC和内皮祖细胞[1]。MSC由于在体外培养时可形成成纤维样细胞集落，故又名成纤维样细胞集落形成单位(colony forming unit firbroblastic,CFUF)。对于原代细胞而言，CFUF集落数目可近似认为是骨髓中MSC的数目，在培养体系中接种相同数量的MNC根据形成CFUF数目的差异可判断MNC中含有的MSC的数量的差异。

　　骨髓干细胞更新与增殖加速并释放到外周血的现象称为骨髓干细胞动员。由于MSC是混合细胞群，无典型的形态特征，也无一个可以专一地鉴定MSC的实验指标，因而无法象研究HSC动员那样直接用CD34+细胞数量差异来研究动员效果。目前鉴定MSC往往通过一系列表面标记和体外诱导分化为骨、软骨、脂肪等后代细胞来反推为MSC。因而，本实验应用了MSC 的体外增殖能力(即成集落能力CFUF)，多向分化能力(成脂，成骨)及细胞表面标记(CD105、CD90、CD34、CD133)进行鉴定。本实验中形成的CFUF经流式细胞术检测显示CD34-、CD133-、CD90+、CD105+，并在体外可成脂，成骨，因此认为分离培养的此类细胞即为MSC。

　　本实验发现，GCSF组骨髓CFUF集落数较对照组明显增加(p<0.01)，初步证实了GCSF有促进骨髓MSC增殖的作用，与Lazarus[2]、Wexler等[3]报道的结果一致，与GCSF对HSC的作用相似。本实验发现，GCSF对MSC同样存在时间效应，动员5天后6小时取材较12小时、168小时取材所形成的CFUF数目多(p<0.01)，12小时与168小时 CFUF数变化不大。这提示GCSF促进骨髓MSC增殖时间较短，高峰出现在GCSF应用5天后6小时左右。由于MSC表面有GCSF的受体，GCSF可与其受体结合促进MSC增殖[4]。

　　由于MSC可分泌多种造血生长因子促进造血，从理论上讲，当HSC与骨髓基质脱离被释放到循环中时客观上也需要支持其造血活动的MSC伴随。如同在个体发育过程中MSC伴随HSC由卵黄囊向肝、脾和骨髓迁移，支持特定部位的造血一样，在临床应用中也发现MSC和HSC的共移植可明显提高造血重建能力。

　　本实验直接将GCSF动员前后的小鼠外周血接种于与骨髓同样的培养体系(10%FBSDMEM)中进行体外贴壁培养时，在动员后的外周血中发现了与骨髓类似的CFUF，同样也存在时间效应，但集落数非常少，细胞增殖慢，无法进一步用流式细胞术检测和进行诱导分化。分析其原因为：

　　(1)GCSF虽可促进骨髓MSC增殖，但促释放作用不强(即有微弱的动员作用)。在同样的培养孔生长面积，血源性MSC贴满培养板底部时,细胞分裂次数需比骨髓源性MSC多，而细胞的集落形成能力一般随着细胞分裂次数增加而降低。

　　(2)有学者认为注射GCSF改变MSC表面黏附分子表达，改变干细胞与细胞外基质(如Ⅵ型胶原等)的结合强度,但可能同时影响MSC体外培养的黏附能力[5]，使培养时形成CFUF的能力减低。

　　(3)目前无公认的从GCSF动员的外周血中分离出MSC的方法。从外周血中分离间充质干细胞的方法均参照从骨髓中分离的方法。基本思路都是将骨髓和外周血中的大量红细胞、白细胞等混杂细胞与MSC分离。然而，不同的研究小组试图从动员后的外周血中分离出MSC,但得出的结论仍有很大争议[2,3,6,7]。有研究认为分离方法是影响外周血MSC培养效率的主要因素。目前从外周血中分离MSC方法大致有5种，按克隆形成率从高到低的顺序依次为流式细胞仪分选法、免疫磁珠分选法、血细胞分离机法、密度梯度离心法、全血细胞分离法。小鼠外周血量不足1 ml。对于有限血量的分离方法可采用的全血细胞法和密度梯度离心法。密度梯度离心分离时去除了大量的红细胞，减少了红细胞沉积于培养板底部影响MSC贴壁的负面作用，但在在反复离心的过程中，细胞的活力较差，获得的细胞太少。因此，本实验采用全血细胞法分离，采用鼠尾胶原包被培养板促进贴壁、首次换液时间控制在48小时以增加贴壁时间等措施来提高培养效率。实践证明，此方法分离的细胞的活性较好，操作简单，污染较少，不失为分离小鼠外周血MSC的较好方法。为了提高外周血MSC的培养效率，近年来开展了微载体悬浮培养等三维培养体系[8,9]，这些方法可进一步提高培养效率。

　　【参考文献】

　　1 Le Blanc K, Pittenger M. Mesenchymal stem cells: progress toward promise. Cytotherapy, 2005; 7: 36-45

　　2Lazarus HM, Haynesworth SE, Gerson SL, et al. Human bone marrowderived mesenchymal (stromal) progenitor cells (MPCs) cannot be recovered from peripheral blood progenitor cell collections. J Hematother, 1997;6:447-455

　　3Wexler SA, Donaldson C, DenningKendall P, et al. Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal stem cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not. Br J Haematol, 2003; 121:368-374

　　4Roufosse CA, Direkze NC, Otto WR. et al. Circulating mesenchymal stem cells. Int J Biochem cell Biol, 2004;36:585-597

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　　7Fernandez M, Simon V, Herrera G, et al. Detection of stromal cells in peripheral blood progenitor cell collections from breast cancer patients. Bone Marrow Transplant .1997;20: 265-271

　　8吴清法,吴祖泽,董波等. 微载体悬浮培养成人骨髓间充质干细胞. 中国实验血液学杂志, 2003; 11:15-21

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