热疗联合化疗对K562/AO2细胞体外作用的实验研究

　　作者：魏红梅,郭坤元,梅家转,常红,宋朝阳,邓　　作者单位：广州市南方医科大学珠江医院血液科，广州 510280

　　【摘要】本研究观察热疗联合阿霉素对耐药慢性髓系白血病细胞系K562/AO2体外增殖的抑制作用、诱导凋亡及对Bcl2及Pgp表达的影响。以MTT法确定阿霉素的工作浓度进行化疗，以40、41和42℃体外加热K562/AO2。加热前及加热后48小时采用台盼蓝拒染法检测肿瘤细胞的存活率，MTT检测肿瘤细胞增殖的抑制作用，流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡、Bcl2及Pgp表达，观察热疗联合阿霉素的抗肿瘤效果。作用48小时的IC50值作为实验的工作浓度。结果表明：与单纯培养相比，40、41和42℃热疗60分钟对K562/AO2细胞有明显地抑制作用(p<0.01),并随温度增高而增强;热疗+化疗组在40、41和42℃时，K562/AO2增殖抑制明显(p<0.01),随着温度的增高而增强。热疗组、化疗组及热疗+化疗组的细胞凋亡率均较对照组显著升高，各组之间均有显著性差异(p<0.01);Bcl2蛋白及Pgp的表达均下降，各组之间也有显著性差异(p<0.01)。结论：热疗联合阿霉素能增强对K562/AO2细胞的体外抑制作用，提高肿瘤细胞的凋亡率,下调Bcl2及Pgp的表达。

　　【关键词】 细胞凋亡

　　Abstract This study was purposed to investigate the inhibitory effect，apoptosis, Bcl2 and Pgp expression of K562/AO2 cells by hyperthermia combined with adriamycin. The working concentration of adriamycin against K562/AO2 was determined by MTT assay. The hyperthermia and chemotherapy were used alone or in combination, then the cell survival rate was detected at 48 hours. The inhibitory effect was evaluated by MTT assay. The apoptosis rate, Bcl2 and Pgp expression of K562/AO2 were determined by flow cytometry. The concentration of adriamycin in the experiment was defined as its IC50 at 48 hours action. The results indicated that the hyperthermia at 40，41 and 42℃ for 60 minutes showed obvious inhibitory effect on K562/AO2 cells (p< 0.01). Adriamycin chemotherapy combined with hyperthermia showed more obvious inhibitory effect on K562/AO2. According to flow cytometric analysis, the hyperthermia and adriamycin used alone or in combination could obviously increase the apoptosis rate and downregulate Bcl2 and Pgp expression of K562/AO2 cells (p<0.01). It is concluded that the adriamycin chemotherapy combined with hyperthermia for 60 minutes shows obvious inhibitory effect on K562/AO2 cells, which increases the apoptosis rate and downregulates expression of Bcl2 and Pgp.

　　Key words hyperthermia; adriamycin; K562/AO2;apoptosis;Bcl2 protein; Pgp

　　白血病,尤其是对耐药白血病缺乏有效的治疗方法。如何提高耐药肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,提高化疗的总体效率是当前白血病治疗中亟待解决的问题。热疗和化疗联合应用在实体瘤中研究较多[1，2]，但对恶性血液肿瘤的研究则报道不多。本研究使用人源的耐药慢性髓系白血病细胞系K562/AO2,观察阿霉素(adriamycin, ADM)与热疗联合对慢性白血病细胞系体外生长的影响及多药耐药蛋白的表达,为临床热疗+化疗联合应用治疗耐药的血液病提供实验基础。

　　材料和方法

　　细胞株

　　人耐药慢性髓系白血病细胞系 K562/AO2 为广州医学院蛇毒研究所馈赠，并由我科实验室传代保存。细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液在37℃、5% CO2条件下常规培养。

　　主要试剂

　　RPMI 1640培养液购自Gibco公司;新生胎牛血清购自杭州四季青生物公司。四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自宝泰克公司;阿霉素购自深圳万乐药业有限公司。

　　主要仪器

　　ELX800全自动酶标仪(芬兰产品)、倒置显微镜(日本产品)、电热恒温水浴箱(上海医用恒业设备厂产品)。

　　实验分组

　　实验设对照组(单纯培养)、化疗组、热疗组和热疗+化疗组,热疗和热疗+化疗分别设40、41及42℃ 3个温度，共设8组。对照组、化疗组K562/AO2细胞均常规培养在37℃的培养箱中。

　　热疗方法

　　电热恒温水浴箱中加热60分钟,温度变化在±0.2℃。

　　药物工作浓度的确定

　　阿霉素设5、10、20、40、80 μg/ml 5个浓度组,每组设3个复孔,以MTT 法测定细胞增殖抑制率,以48小时的IC50值作为试验的工作浓度。IC50的数值按IC50软件计算获得。

　　细胞存活率的台盼蓝拒染法检测

　　分别取各组细胞悬液，使每组细胞数相同，分别吸出0.9 ml均匀细胞液加0.1 ml 0.4%的台盼蓝染色，细胞变蓝者为死细胞，每瓶细胞计数3次，取均值。

　　细胞存活率=[活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)]×100%。

　　细胞增殖的MTT法测定

　　取对数生长的肿瘤细胞,按每孔200 μl(103)接种到96孔培养板中,分别给予热疗、化疗或热疗+化疗处理,继续培养48小时,加入MTT 20 μl,继续培养4小时，加入150 μl DMSO,应用全自动酶标仪,选490 nm为测定波长,测定OD值,计算细胞增殖抑制率。实验重复3次。

　　细胞增殖抑制率=[(对照组OD均值-实验组OD均值)/对照组OD均值]×100%

　　细胞凋亡的流式细胞术检测

　　取对数生长的K562/AO2细胞接种于50 ml的培养瓶,每瓶细胞数为2×105,分组处理后继续培养,48小时收集细胞,以冷磷酸盐缓冲液(PBS)处理,加入300 μl DNA染液,FCM检测。试验重复3 次。

　　Bcl2表达的流式细胞术检测

　　取对数生长的K562/AO2细胞接种于50 ml的培养瓶,每瓶细胞数为2×105,选取41℃为试验温度,分组进行处理后继续培养,48小时收集细胞,用PBS处理，加入100 μl破膜剂及5 μl Bcl2/FITC和Mouse IgG1/FITC,FCM检测。试验重复3次。

　　Pgp表达的流式细胞术检测

　　取对数生长的K562/AO2细胞接种于50 ml的培养瓶,每瓶细胞数为2×105,选取41℃为试验温度,分组处理后继续培养,48小时收集细胞,用PBS处理，加入10 μl Pgp/FITC和Mouse IgG1/FITC,于37℃冰箱内孵育60分钟,FCM检测。试验重复3次。

　　统计学处理

　　应用SPSS 11.0软件进行数据处理，结果采用均数±标准差(±SD)表示，采用单向方差分析(Oneway ANOVA)。

　　结 果

　　阿霉素工作浓度的确定

　　不同浓度的阿霉素作用K562/AO2细胞48小时的抑制率分别为(18.6±2.0)%、(26.4±3.2)%、(34.8±5.0%)、(42.6±3.8)%及(58.4±3.8)%。IC50为53 μg/ml，并以此药物浓度进行各项试验。

　　细胞的存活率

　　试验前细胞存活率100%。各组细胞处理后48小时检测结果显示，化疗组、热疗组及热疗+化疗组的细胞生存率均较对照组细胞生存率低,并有显著性差异(p<0.01);3种温度的热疗+化疗组的细胞生存率均显著低于热疗组和化疗组(p<0.01);42℃的热疗+化疗组与40℃的热疗+化疗组之间细胞的存活率有显著性差异(p<0.01),42℃与41℃、41℃与40℃的热疗+化疗组之间细胞的存活率无显著性差异(p>0.05)。

　　细胞的抑制率

　　单纯40℃、41℃及42℃热疗60分钟后48小时检测显示热疗对K562/AO2细胞均有抑制作用,抑制作用随温度增高而增强(p<0.01);单纯阿霉素组对K562/AO2细胞系也有一定的抑制作用;3种温度的热疗+化疗组的细胞抑制率均显著低于热疗组和化疗组(p<0.01);42℃的热疗+化疗组与40℃的热疗+化疗组之间细胞的抑制率有显著性差异(p<0.01),42℃与41℃、41℃与40℃的热疗+化疗组之间细胞的抑制率无显著性差异(p>0.05)。

　　细胞的凋亡率

　　在40℃、41℃及42℃温度下，48小时检测K562/AO2细胞的凋亡情况发现：热疗组及热疗+化疗组细胞凋亡率较对照组明显升高(p<0.01);化疗组与对照组相比差异无显著性(p>0.05)。热疗+化疗组的细胞凋亡率均较单纯热疗及单纯化疗的细胞凋亡率明显升高(p<0.01)。上述作用均随温度的增加而增强。

　　Bcl2的表达率

　　41℃作用60分钟后48小时检测K562/AO2细胞内Bcl2的表达率显示：热疗+化疗组细胞Bcl2表达率明显下调;化疗组、热疗组及热疗+化疗组细胞Bcl2表达率与对照组相比均有显著差异(p<0.01);热疗+化疗组细胞Bcl2表达率分别与热疗组、化疗组相比，均有显著差异(p< 0.01)。

　　Pgp的表达率

　　41℃作用60分钟后48小时检测K562/AO2细胞内Pgp的表达率显示：热疗+化疗组细胞Pgp表达率明显下调;化疗组、热疗组及热疗+化疗组细胞Pgp表达率与对照组相比均有显著差异(p<0.01);热疗+化疗组细胞Pgp表达率分别与热疗组、化疗组相比，均有显著差异(p<0.01);热疗组与化疗组相比无显著性差异(p>0.05)(表2、图2)。

　　讨 论

　　目前肿瘤化疗失败的原因主要是肿瘤的耐药性，其中最重要的为多药耐药性(MDR)。MDR产生机制非常复杂，但目前能在临床证实与一些肿瘤多药耐药相关的只有由mdr1基因编码的P糖蛋白(Pglycoprotein,Pgp),Pgp过度表达是经典的多药耐药途径。Pgp具有多种功能，可能量依赖性地将药物泵出细胞外，使细胞内蓄积