同种异基因造血干细胞移植受者血清白介素18水平与急性移植物抗宿主病的关系

　　作者：柳金,张献共,陆道培　　作者单位：北京大学人民医院血液病研究所，北京 100044; 1北京大学深圳医院血液科，深圳 518036

　　【摘要】本研究探讨同种异基因造血干细胞移植(alloHSCT)受者血清白介素18(IL18)与急性移植物抗宿主病(aGVHD)的关系，查明血清IL18在aGVHD发病中的作用，为临床早期预测aGVHD提供可靠指标。采用双夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测62例alloHSCT患者移植前及移植后aGVHD发生前后血清IL18表达水平。62例患者被分为5组：A组为无aGVHD移植前组(28例)，指移植后没有发生aGVHD的患者在移植前收集的标本;B组为有aGVHD移植前组(34例), 指移植后发生aGVHD的患者在移植前收集的标本;C组为aGVHD症状前组(34例), 指临床出现I-II级aGVHD症状前3-4天的标本;然后根据I-II级aGVHD患者治疗后，有无进展至III-IV级回顾性地将aGVHD前组患者分为疗效好组(18例)和疗效差组(16例);D组为I-II级 aGVHD组;E组为III-IV级aGVHD组(16例)。结果表明： 34例患者发生I-II级aGVHD，其中16例aGVHD进展至III-IV级;发生aGVHD患者的血清IL18表达水平显著高于未发生aGVHD患者, 血清IL18表达水平上升发生在aGVHD临床症状出现前3天左右;血清IL18表达水平与aGVHD的严重程度呈正相关,与HLA配型、预处理方案及感染无关;aGVHD早期血清IL18表达水平与预后相关;血清IL18高表达者aGVHD容易进展至IIIIV级。结论： 血清IL18 与aGVHD的发病相关联,检测血清IL18 水平有助于aGVHD早期诊断，血清IL18表达水平可作为评估aGVHD病情、判断预后的指标。

　　【关键词】 同种异基因造血干细胞移植 白介素18 急性移植物抗宿主病 早期预测

　　Abstract This study was aimed to investigate the correlation between the serum levels of IL18 and acute graft versus host disease (aGVHD) in patients received allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (alloHSCT)， and to explore the role of serum IL18 levels in the pathogenesis of aGVHD so as to provide a reliable and early indicator for the diagnosis of aGVHD. 62 patients received alloHSCT were enrolled in this study. Before and after transplantation, as well as at onset of aGVHD. the serum levels of IL18 were analyzed by ELISA. 62 patients were divided into 5 groups: group A without aGVHD (28 cases) referred to the patients who had no aGVHD after transplantation and whose specimen were collected before transplantation; group B with aGVHD before transplantation (34 cases) referred to the patients who had aGVHD after transplantation and whose specimen were collected before transplantation; group C before the onset of aGVHD (34 cases) referred to patients with I-II grade a GVHD whose specimen were collected before 3-4 days, and according to whether the I-II grade aGVHD patients developed III-IV grade or not after treatment, these patients were divided into two subgroups retrospectively, one subgroup had good curative effect ( 18 cases) and the other subgroup had not (16 cases); group D with I-II grade aGVHD; group E with III-IV grade aGVHD (16 cases). The results showed that 34 patients developed I-II grade aGVHD, then out of them 16 patients (16/34) developed III-IV grade aGVHD. The serum levels of IL18 in these patients with aGVHD were higher than that in patients without aGVHD. About 3 days before onset of aGVHD, the serum levels of IL18 started to increase. The serum levels of IL18 were correlated with the severity of aGVHD, but no correlation was found with infection, conditioning regimens and disparity of HLAtyping. The serum levels of IL18 in the early stage of aGVHD were correlated with prognosis. The aGVHD of patients with higher serum levels of IL18 easy developed to IIIIV grade aGVHD. It is concluded that the serum level of IL18 in the patients received alloHSCT is related to the occurrence of aGVHD. Detections of serum IL18 are helpful for the early diagnosis of aGVHD, and the serum levels of IL18 may be considered as a reliable indicator to evaluate the prognosis and severity of aGVHD.

　　Key words allogeneic hematopoietic stem cell transplantation; IL18; acute graftversushost disease; early prediction

　　中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(3)同种异基因造血干细胞移植受者血清白介素18水平和急性移植物抗宿主病的关系 急性移植物抗宿主病(aGVHD)是同种异基因造血干细胞移植(alloHSCT)的主要并发症之一。已有的研究表明，aGVHD 发生与细胞因子密切相关[1-4]。目前临床上主要根据皮肤、肝脏、胃肠道受累症状的出现和程度对aGVHD进行诊断和分级，缺乏直接的免疫学证据，因此需要寻找一种能够直观、实时反映aGVHD的免疫学指标。本研究采用双夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测62例alloHSCT患者(其中HLA配型不合/单倍型相合的34例)移植前及移植后aGVHD发生时血清IL18表达水平，以探讨血清IL18在aGVHD发病中的作用，为临床早期诊断aGVHD提供可靠指标。至今为止，有关alloHSCT后血清IL18水平报道，均为HLA全相合单纯alloBMT或alloPBSCT受者血清IL18水平检测结果，我们第一次报道HLA配型不合/单倍型相合alloBMT加alloPBSCT受者血清IL18水平与aGVHD的关系。

　　材料和方法

　　病例

　　62例alloHSCT患者为2004年1月至2004年11月期间北京大学人民医院血液病研究所骨髓移植病房住院病人, 男43例，女19例，中位年龄30(9-49)岁。62例中诊断为急性淋巴细胞白血病(ALL)13例, 急性髓系白血病(AML)15例, 慢性髓系白血病(CML)27例,骨髓增生异常综合征(MDS)3例,非霍杰金淋巴瘤(NHL)2例，再生障碍性贫血(AA)1例，多发性骨髓瘤(MM)1例。HLA配型全相合28例，HLA配型不合34例，1个位点不合4例,2个位点不合18例,3个位点不合12例。所有患者均签署知情同意书。本研究选择34例I-II级aGVHD患者(HLA配型不合和全相合分别为20和14例)，其中16例为I-II级进展至III-IV级aGVHD患者(HLA配型不合和全相合分别9例和7例)，同时选择28例无aGVHD患者作为对比(其中HLA配型不合和全相合各14例)。aGVHD的诊断及分级参照参考文献[5]。62例患者分为5组： A组为无aGVHD移植前组(28例)，指移植后没有发生aGVHD的患者在移植前收集的标本; B组为aGVHD移植前组(34例), 指移植后发生aGVHD的患者在移植前收集的标本; C组为aGVHD症状前组(34例), 指临床出现I-II级aGVHD症状前3-4天的标本, 根据I-II级aGVHD患者治疗后，有无进展至III-IV级回顾性将aGVHD前组患者分为疗效好组(18例)和疗效差组(16例); D组为I-II级 aGVHD组; E组III-IV级aGVHD组(16例)。28例无aGVHD组与34例有aGVHD组中位年龄无显著差异(P>0.05)。另设感染组(24例)，是指没有合并aGVHD时单纯感染患者的标本。

　　血清标本采集

　　分别于移植预处理前、预处理后输注干细胞前，移植后住院期间每周1、4采集外周静脉血标本5ml，血液标本经离心后取血清于-80度冻存备用。

　　血清IL18检测

　　患者血清IL18水平采用人IL18试剂盒(由深圳市炬英生物科技有限公司提供)用ELISA法检测。主要步骤如下：在微孔板留一空白对照孔,其他孔加血清标本或不同浓度标准品100 μl,加入50 μl生物素标记的抗体;室温孵育3小时后洗涤3次，加入100 μl酶结合物;室温孵育30分钟后洗涤3次，加入100 μl底物;室温避光，显色12至15分钟，加100 μl硫酸，终止反应，450 nm处读取OD值。试剂盒的最小检测浓度为45 pg/ml。

　　HLA配型、预处理方案 、供者造血干细胞动员及采集 、GVHD预防、植活检测

　　HLA配型 A、B位点检测方法为低分辨方法，DR位点采用高分辨方法。

　　预处理方案 阿糖胞苷4 g/m2，HLA配型全相合者用1天(移植前10天)，HLA配型不合者用2天(移植前10，移植前9天);Bu(马利兰) 2 mg/(kg•d)×3天; 环磷酰胺1.8 g/(m2•d)×2天;甲基环己亚硝脲(MeCCNu)250 mg/m2×1天。

　　供者造血干细胞动员及采集 供者接受rhGCSF(日本中外制药株式会社产品)5 μg/(kg•d)，连续皮下注射5-6天，第4天采集骨髓有核细胞;第5至6天采集PBSC，总单个有核细胞数(3-4)×108/kg。

　　GVHD预防 在经典的环孢菌素A加短程甲氨喋呤方案基础上，加用霉酚酸酯，HLA配型不合者加用抗人胸腺细胞球蛋白预防GVHD。

　　植活检测 造血重建均经性染色体、PCRSTR指纹图或HLA不合位点位点配型中2项以上证实为完全嵌合体。

　　结 果

　　造血重建

　　28例无aGVHD组与34例aGVHD组输注有核细胞数分别为(8.12±3.31)×108/kg、(7.60±3.0)×108/kg，两者无显著差异(P>0.05)。所有患者均获得造血重建，移植后中性粒细胞>0.5×109/L的中位时间在合并aGVHD组为14(10-20)天,而在无aGVHD组为15(11-25)天,两者无显著性差别(P>0.05)。

　　血清IL18与aGVHD发病关系

　　34例合并aGVHD组与28例无aGVHD组之间移植前血清IL18水平分别为72.01±27.18、68.89±27.95 pg/ml,两组无显著差异(P>0.05);移植后合并aGVHD患者，发生III-IV级aGVHD组血清IL18水平高于I -II级GVHD组(P<0.01),而I-II级aGVHD组高于aGVHD症状前组(P<0.01); aGVHD症状前组血清IL18水平比较移植前有显著升高(P<0.01)，即在临床出现aGVHD症状前3天血清IL18水平已经显著上升。

　　aGVHD患者血清IL18表达水平动态变化

　　18例I-II级aGHVD患者患病时与治疗缓解后血清IL18水平分别为396.26±56.44和230.72±46.15 pg/ml,前后比较差异显著(P<0.05)。16例aGVHD从I-II级发展到III-IV级的患者,血清IL18水平与aGVHD严重程度成正相关,相关系数=0.909, P<0.01。

　　血清IL18与aGVHD预后关系

　　根据有无进展至III-IV级aGVHD,回顾性地将34例aGVHD症状前组患者分为疗效好组(n=18)和疗效差组(n=16)，两组血清IL18值分别为317.88±47.29和499.46±102.18 pg/ml, 疗效差组血清IL18水平显著高于疗效好组(P<0.01)。

　　血清IL18与感染关系

　　检测了24例患者移植前与感染发生时血清IL18的水平,分别为69.33±26.57和82.86±31.51 pg/ml,前后比较差异无显著性(P>0.05)。

　　血清IL18与预处理方案关系

　　检测34例单倍型相合患者预处理前与预处理后血清IL18表达水平，两组分别为67.27±27.72和80.7±29.54 pg/ml，无显著差异(P>0.05)。

　　血清IL18与HLA配型关系

　　HLA配型全合组与不合组患者在移植前、移植后aGVHD时血清IL18水平比较显示，全相合组与不相合组无显著差异(P>0.05),但无论是HLA配型全相合组与不相合组患者, aGVHD症状前组、I-II级aGVHD组、III-IV级aGVHD组血清IL18水平，与移植前比较均显著升高(P<0.01)。

　　讨 论

　　aGVHD的发病机制为造血干细胞移植供者的T淋巴细胞被受者组织抗原激活，这些细胞的增殖、活化与多种细胞因子(CK)及表面分化抗原(CD分子)有关。GVHD发病机制研究发现，CD4+细胞中辅助性T淋巴细胞1(Th1)亚群与GVHD相关，Th1细胞主要分泌IL2,INFγ等(I型炎症因子)，IL2和IFNγ在aGVHD发病中起关键作用,控制和放大对异体抗原的免疫应答,并刺激单核细胞分泌多种炎性细胞因子,最终导致aGVHD靶组织的损伤,而细胞因子IL4和IL10在aGVHD的发病过程中起抑制作用[6,7]。Fas/FasL系统是介导凋亡的主要途径，表达于包括GVHD靶器官在内的多种器官，鼠实验表明，Fas缺陷者移植后GVHD发生及致死率较高，并伴有血清IFNγ与TNFa水平升高，提示Fas/FasL也参与了GVHD的发病机制[8]。IL18是1995年发现的一种细胞因子, 是18.3 kD的蛋白质。IL18具有如下免疫调节活性： ①促进T细胞增殖,增强Th1单克隆和富集的多克隆T细胞产生Th1类细胞因子，增强Th1细胞毒效应 ,同时可以抑制IL4和IL10的产生[9];②增加NK细胞的细胞毒作用：在体外实验中, IL 18 可以增强外周血和脾脏天然杀伤细胞的活性,明显增强NK细胞的细胞毒作用,且呈剂量依赖性;③直接增强FasL 介导的Th1 细胞毒效应[10] 。因此,我们设想IL18在造血干细胞移植后的aGVHD发病中起着重要的作用。

　　国内外有关alloHSCT后血清IL18水平报道较少，所见的均为HLA全相合单纯alloBMT或alloPBSCT受者IL18水平检测结果,未见HLA配型不相合/单倍相合alloBMT加alloPBSCT受者血清IL18水平报道。 Fujimori 等[1]用ELISA法检测37 例恶性血液病alloBMT前后血清IL18 水平，aGVHD病人血清IL18 的浓度明显增高并且与其严重程度相一致,在aGVHD得到适当的治疗后，血清 IL18 的水平降至正常，血清IL18 水平不受移植前化疗方案、移植物或细菌感染的影响，提示IL18 在aGVHD 的病理过程中可能起重要的作用，血清IL18 的水平对预测aGVHD是有价值的。Nakamura等[2]检测18例alloBMT后血清IL18浓度,国内徐敏等[3]和居小萍等[4]分别检测10例和15例alloPBSCT后GVHD患者IL18 水平,结果与上述报道一致。

　　我们检测并比较28例HLA相合、34例HLA配型不相合/单倍相合HSCT受者血清IL18 水平，结果发现IL18 水平与HLA配型无关，无论HLA相合、还是HLA配型不合/单倍型相合造血干细胞移植受者中发生aGVHD患者的IL18表达水平均显著高于未发生aGVHD患者, IL18表达水平与aGVHD的严重程度呈正相关, 与文献报道一致,提示血清IL18水平 与aGVHD的发病相关联,检测血清IL18 水平有助于aGVHD早期诊断。本组结果显示，在aGVHD早期时, 疗效差，进展至IIIIV级aGVHD组血清IL18 水平显著高于疗效好组，这提示血清IL18水平在一定程度上可作为判断aGVHD的预后指标。目前对aGVHD的防治较为困难，常用的药物如环孢菌素等对某些进展或重度aGVHD患者疗效可能不佳，早期诊治可以及时控制aGVHD发展，改善预后。但目前临床上主要根据症状的出现和程度对aGVHD进行诊断，缺乏直接的免疫学证据，早期症状往往不典型，且容易与感染混淆，以至延误治疗。本研究证实，血清IL18表达水平与感染的发生无关，而发生aGVHD患者的血清IL18表达水平显著升高，血清IL18表达水平在aGVHD 临床症状出现前3天左右已经明显上升，提示检测血清IL18 水平对aGVHD有较高的特异性，有利于早期预测aGVHD。

　　【参考文献】

　　1Fujimori Y, Takatsuka H, Takemoto Y, et al. Elevated interleukin18 levels during acute graftversushost disease after allogeneic bone marrow transplantation. Br J Haematol, 2000; 109:652-657

　　2Nakamura H, Komatsu K, Ayaki M, et al. Serum levels of soluble IL2 receptor, IL12, IL18, and IFNgamma in patients with acute graftversushost disease after allogeneic bone marrow transplantation. J Allergy Clin Immunol, 2000; 106(pt2):S45-S50

　　3徐敏, 刘国强,邢健等. 细胞因子与急性移植物抗宿主病的关系. 中华内科杂志，2005; 44:170-135

　　4居小萍,王健民,侯军等. 白细胞介素18在急性移植物抗宿主病. 中国实验血液学杂志,2002;10:452-454

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　　6黄成龙，毛秉智. 骨髓移植后GVHD发病机制及防治研究概况. 中国实验血液学杂志,1994; 2:133-139

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　　10任莉莉，李富荣. IL  18 在免疫相关性疾病发病机制中的意义. 广东医学，2