急性白血病患者氧化应激状态与抑郁情绪之间的关系

　　作者：周芙玲,张王刚,苏智祥,蒙昕,田纬　　作者单位：

　　【摘要】本研究探讨急性白血病患者氧化应激状态与抑郁情绪之间的关系。用抑郁自评量表(self-rating depression scale， SDS)等调查表对92例初发急性白血病患者的抑郁症状进行评定。检测血浆总抗氧化能力(T-AOC)、活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及一氧化氮(NO)含量。采用实时定量PCR检测DNA修复基因人8- 羟基鸟嘌呤糖苷酶(human 8-hydroxyguanine glycosylase，hOGG1)的表达。结果证明，急性白血病患者抗氧化酶防御能力下降，抑郁情绪发生率47.83%，伴抑郁障碍的患者T-AOC和SOD水平明显降低，ROS、NO及MDA水平明显升高，DNA修复基因hOGG1 mRNA的表达升高。急性白血病患者病程、hOGG1水平与抑郁程度呈正相关，T-AOC水平与抑郁程度呈负相关。结论： 急性白血病患者存在氧化损伤，伴抑郁症状的患者抗氧化酶防御能力进一步减弱,提示氧化应激与急性白血病抑郁症状的发生和发展密切相关。

　　【关键词】 氧化应激;急性白血病;抑郁;DNA修复基因hOGG1

　　AbstractThis study was aimed to investigate the relationships between oxidative stress and depression in patients with acute leukemia. Ninety two cases of acute leukemia were randomly enrolled in the study. Depressive disorder was assessed by self-rating depression scales (SDS) and multiple items questionaires. The total anti-oxidation capability (T-AOC), reactive oxygen species (ROS) and superoxide dismutase (SOD) activities, as well as malondialdehyde (MDA) and nitric oxide (NO) levels were measured in pre-treatment periods. Meanwhile, the steady state level of human 8-hydroxyguanine glycosylase(hOGG1)mRNA transcript was monitored by quantitative real-time PCR. The results showed that the defence of antioxidant system was impaired in patients with acute leukemia. The incidence of depression was 47.83% in 92 cases. T-AOC and SOD activities were significantly decreased in patients with depression，while ROS, NO, MDA levels and hOGG1 mRNA expression were reverse of the former. It revealed that depression positively correlated with course of disease and hOGG1, and negatively correlated with T-AOC. It is concluded that oxidative damage occurs in patients with acute leukemia, moreover, lower antioxidant defences exist in depressive patients. These results underscore the notion that oxidative stress may promote the development of depression.

　　Key wordsoxidative stress; acute leukemia; depression; hOGG1

　　氧化应激(oxidative stress)是指机体或细胞内氧自由基的产生与清除失衡,导致活性氧(reactive oxygen species, ROS)和活性氮(reactive nitrogen species, RNS)在体内或细胞内蓄积而引起的氧化损伤过程。近年来研究显示，氧化应激可促进DNA损害、遗传突变等并导致肿瘤发生[1-4]。肿瘤患者普遍存在心身疾病[5-7]，但国内外有关氧化应激状态与肿瘤患者心身疾病关系的报道少见。本研究通过研究初发急性白血病患者血浆中活性氧类物质、抗氧化酶防御系统及DNA氧化损伤修复基因hOGG1的水平，对初发急性白血病患者机体抗氧化状态与抑郁情绪之间的关系做了一些初步分析。

　　材料和方法

　　临床资料

　　92例患者均为2004年3月到2005年7月在西安交通大学第二医院血液科经骨髓穿刺等检查确诊的急性白血病初发患者，其中男54例，女38例，中位年龄45(19-73)岁。按FAB病理分型：急性非淋巴细胞白血病(ANLL ) 62 例(M1 5例，M2 16例，M3 14例，M4 8例，M5 15例，M6 4例) ，急性淋巴细胞白血病(ALL) 30例(L1 14例，L2 10例，L3 6例)。92例患者在本研究前1月未曾服用抗抑郁药及抗氧化剂，心、肝、肾功能基本正常，既往无精神病史、酒精和药物依赖病史，无脑器质性疾病和内分泌疾病史，无严重认知障碍。取20名正常人外周血作正常对照，与急性白血病组间性别、年龄等资料对比差异无显著性。

　　抑郁自评

　　抑郁自评量表(self-rating depression scale，SDS)含有20个项目、四级评分。统计指标为总分，由研究者计算并判断，总分≥50表示有不同程度的抑郁症状，分数越高表示症状越重。

　　多项目问卷调查

　　多项目调查问卷包括患者的一般人口社会学资料等内容，调查遵循了伦理学、患者知情认知及医师对调查资料完全保密等原则。

　　氧化应激检测

　　用氧化应激指标检测试剂盒(由南京建成生物公司提供)，按照说明书操作检测。

　　T-AOC、ROS、SOD、MDA、NO检测

　　用Fe3+还原法测定血浆总抗氧化能力(T-AOC)，采用Fenton 反应及Gress 显色原理测定活性氧(ROS)，黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)，硫代巴比妥酸法(TBA)测定丙二醛(MDA)含量，硝酸还原酶法测定一氧化氮(NO)。

　　实时定量PCR检测

　　取肝素抗凝新鲜人外周血5 ml，淋巴细胞分离液[密度1 g/cm3(20℃)]分离外周血单个核细胞，加入TRIZOL(Invitrogen公司产品)，抽提总RNA。紫外吸收测定法检测RNA浓度和纯度，A 260 nm/A 280 nm比值在1.8-2.1之间。采用变性琼脂糖凝胶电泳, 紫外透射光下观察并拍照。5 μg总RNA经oligo(dT) 引物逆转录合成cDNA，逆转录反应为37℃ 1小时、95℃ 5分钟，cDNA溶液储存于-20℃备用。由上海康成生物公司合成引物，hOGG1正义引物： 5'- CCCCAGACCAACAAGGAACT-3'; 反义引物： 5'-TGGAACCCTTTCTGCGCTTT-3'，扩增片段145 bp;管家基因正义引物： 5'- CCTGTACGCCAACACAGTGC-3';反义引物： 5'-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3'，扩增片断211 bp。定量阳性模板扩增曲线以hOGG1模板起始拷贝数的常用对数为横坐标，循环阈值为纵坐标，得到标准曲线，相关系数r=0.99991。荧光定量PCR反应体系25 μl： SybergreenⅠ(Invitrogen公司产品) 终浓度6.25 μl，25 mmol/L MgCl2 溶液3 μl， 20 μmol/L 的PCR特异引物各0.5 μl，Taq聚合酶3 U， dNTP混合液3 μl，cDNA 1 μl。 反应条件(Rotor-Gene3000 Realtime PCR仪): 94℃5分钟，40个循环(94℃ 10秒，58℃ 15秒，72℃ 20秒)。PCR产物与100 bp DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，GoldViewTM染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。hOGG1与β-actin绝对拷贝数之比，作为hOGG1基因的相对表达量。

　　统计学分析

　　本研究共发出问卷109份，收回有效问卷 92份，回收率为84.40%。 采用SPSS 11.5统计软件处理，原始数据组间方差齐时用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间比较用Dunnett-t检验，检验水准α=0.05;组间方差不齐时用Kruskal-Wallis H检验， 组间比较采用Mann-whitney U检验，检验水准α=001。各项目间进行Person相关分析。

　　结果

　　分组比较

　　研究分3组，A 组44例抑郁型急性白血病患者，占47.83%，SDS评分≥50分;B组48例非抑郁型急性白血病患者，SDS评分<50分;C组20名健康对照者。经统计分析，A 组患者T-AOC和SOD水平明显低于B组及C组;ROS、NO及MDA水平明显升高，其中ROS水平明显高于C组， MDA水平明显高于B组及C组;伴抑郁障碍的急性白血病患者DNA修复基因hOGG1 mRNA的表达升高。总RNA变性琼脂糖凝胶电泳及hOGG1 基因的扩增曲线; 3组之间DNA修复基因hOGG1 mRNA的表达差异无统计学意义。

　　各项目之间的Person相关分析

　　抑郁与病程、hOGG1明显正相关，与T-AOC水平负相关; hOGG1 与T-AOC和SOD水平明显负相关; T-AOC与NO负相关。

　　讨论

　　在生理条件下，抗氧化酶和抗氧化剂的协同作用使自由基维持在极低水平。当其生成超出机体的清除和修复能力时，血浆含有的高浓度ROS(包括OH- 、O2- 、H2O2 等)都可直接氧化、攻击和破坏抗氧化酶，使酶的活性降低或丧失;氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化反应，形成脂质过氧化终产物。一氧化氮属于一种活性很强的自由基，既是生物体内的信息分子和效应分子， 也是一种重要细胞毒性分子，与肿瘤关系密切。抑郁是一种负性情绪，Tsuboi等[8]和Ozcan等[9]临床研究发现，抑郁具有促进脂质过氧化作用, 降低GSH、过氧化氢酶(CAT)、SOD、NO 活性和提高MDA 含量。本研究结果显示，急性白血病患者T-AOC和SOD水平明显降低，ROS、NO及MDA水平升高，伴抑郁症状的患者变化更明显。由此可见，ROS作为一种介质和自由基参与急性白血病发生，与NO具有协同作用。急性白血病患者自由基酶防御系统功能降低，自由基水平升高加速白血病的进展，也可能促进抑郁情绪发生。生物的抗氧化能力有一定限度，在一些情况下DNA遭到活性氧的攻击会造成各种各样的DNA 损伤，诸如碱基修饰、脱嘌呤或脱嘧啶位点(AP) 形成、DNA 单链断裂(SSB)，以及DNA-蛋白质交联等。氧自由基攻击DNA或RNA形成频率很高的8-氧鸟嘌呤(8-oxoguanine, oxoG)，后者具有强的致突变能力，与肿瘤的发生发展有着密切的关系[10，11]。抑郁属于一种强烈的应激反应，可以触发DNA氧化损伤[12,13]。通过对DNA修复机制的多年研究，已明确8-羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶(8-oxoguanine DNA glycosylase 1， hOGG1)基因编码的蛋白参与8-羟基鸟嘌呤的切除，从而保护遗传物质不受损伤，在修复氧自由基致DNA损伤及抑制基因突变方面有重要作用[14-16]。实时荧光定量PCR是指通过仪器连续监测整个PCR扩增过程中荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断hOGG1基因的初始量。本研究使用管家基因β-actin作为内参照检测样品中hOGG1 mRNA的表达，实验结果提示，急性白血病患者DNA修复基因hOGG1 mRNA的表达有所升高，伴抑郁障碍的患者升高较明显。这进一步说明，在疾病初期急性白血病患者机体氧化损伤和抗氧化同时起作用，伴抑郁症状的患者体内DNA氧化损伤相对较重。因此，研究自由基变化规律，对急性白血病及其相关症状进行早期诊断，以及有效利用抗氧化剂提高治愈率和改善生活质量，都具有一定的临床应用价值。

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