小鼠酒精性肝纤维化复合模型的建立及肝组织骨桥蛋白和转化生长因子β1的表达

酒精性肝纤维化为酒精性肝病进展过程的关键病理学阶段,建立稳定的动物模型是探明其发病机制及防治策略的关键。目前尚缺乏理想的酒精性肝纤维化动物模型,国内多采用灌胃法,死亡率高,成功率较低。Lieber-DeCarli乙醇液体饲料建立ALD模型为国际公认的ALD动物模型,然而其造模周期长,病理学改变以肝脂肪变为主,难以形成肝纤维化。本研究探索Lieber-DeCarli乙醇液体饲料联合微量四氯化碳腹腔注射建立小鼠酒精性肝纤维化复合模型,并观察肝组织病理学动态变化及骨桥蛋白、转化生长因子β1(TGFβ1)表达的动态变化,以期为探明酒精性肝纤维化发病机制及有效防治策略提供研究平台。　　材料与方法　　1.动物模型建立及标本采集:7~8周龄健康⒒雄性C57BL/6J小鼠(购自中国医学科学院实验动物研究所)64只,体质量20~25g,随机分为5组:(1)对照组(n=6):对照饲料喂养;(2)四氯化碳组(n=6):对照饲料喂养,自造模第5周起,腹腔注射5%四氯化碳橄榄油(购自国药集团化学试剂有限公司)溶液2ml/kg,2次/周;(3)乙醇组(n=6):含4%乙醇(购自河北衡水老白干酿酒(集团)有限公司Lieber-DeCarli液体饲料(购自江苏南通特洛菲饲料科技有限公司)喂养;(4)溶剂对照组(n=6):乙醇液体饲料喂养,自造模第5周起,腹腔注射橄榄油2m/kg,2次/周;(5)乙醇+四氯化碳组(n=40):乙醇液体饲料喂养,自造模第5周起,腹腔注射5%四氯化碳橄榄油溶液2d/kg,2次/周。Lieber-DeCarli乙醇液体饲料热量构成比:乙醇36%,蛋白质18%,脂肪35%,碳水化合物11%,对照饲料以等热量麦芽糊精代替乙醇。乙醇液体饲料喂养的各组小鼠,于造模之前2周以2%~4%逐渐增加乙醇浓度,以乙醇浓度4%记为造模开始时间。乙醇+四氯化碳组小鼠,于造模开始及第4、5、6、7、8周各处死6只,其余各组小鼠于造模第8周处死,留取血清及肝组织标本。部分肝组织用4%中性甲醛溶液固定,其余肝组织用液氮快速冷冻,置于-80℃冰箱保存,备用于提取蛋白及RNA。　　2.一般观察指标、肝脏形态学及血清学指标:动物一般情况,包括体质量、精神状态、活动情况、皮毛光泽度、进食量、大小便等;肝脏质量及形态学,包括肝脏质量、外形、色泽、质地等;血清ALT、AST水平检测,应用OlympusUA2700全自动生物化学仪(购自日本Olympus公司),采用酶法进行检测。　　3.肝组织病理学观察:肝组织石蜡包埋,常规切片,行HE及Masson染色,光镜下观察肝脂肪变、炎症及肝纤维化动态改变。参照2010年《酒精性肝病诊疗指南》及Dominguez等制定的ALD组织学评分系统对肝组织病理学改变进行评分:(1)气球样变(0=无,1=轻~中度,2=重度);(2)脂肪变性程度(0≤10%,1=10%~33%,2=33%~66%,3≥66%);(3)炎症坏死(0=无,1=轻度,2=中度,3=重度);(4)小叶纤维化(0=无,1=3带为主,2=2及3带,3=全小叶);(5)纤维化分期(0=无纤维化,1=汇管区纤维化,2=汇管区纤维化及纤维间隔形成,3=纤维间隔形成但未至肝硬化,4=肝硬化)。　　4.肝组织α-平滑肌肌动蛋白表达检测:采用免疫组织化学染色。肝组织石蜡包埋,常规切片,切片脱蜡;高压修复抗原2min;α-SMA单克隆抗体(购自美国SantaCruz公司),4℃过夜;山羊抗小鼠免疫球蛋白G抗体-辣根过氧化物酶多聚体,37℃孵育30min;DAB显色2min,自来水终止显色;苏木素复染,无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。以0.01mol/L磷酸盐缓冲液代替第一抗体作为空白对照。棕黄色着色为阳性表达。　　5.肝组织OPN及TGFβ1mRNA表达检测:应用实时定量RT-PCR分析。OPN上游引物:5′-GGTGATAGCTTGGCTTATGGAC-3′,下游引物:5′-CCTTAGACTCACCGCTCTTCAT3′,TGFβ1~L游引物:5′-CAACGCCATCTATGAGAAAACC名′,下游引物:5′-ACTGCCGTACAACTCCAGTGAC3′。应用TRNzol试剂(购自北京天根生物化学科技有限公司)提取肝组织总RNA,用寡脱氧核苷酸和MMLV逆转录酶(购自加拿大Fementas公司)制备cDNA。用ABITaqDNA聚合酶(购自北京天根生物化学科技有限公司)扩增cDNA产物,用ABIPRISM7500序列检测系统测定mRNA转录数,计算mRNA拷贝和循环数的线性关系,并依此计算实验标本OPN及TGFβ1相对表达量。　　6.肝组织OPN及TGFβ1蛋白表达检测:用Westernblot方法,以含蛋白酶抑制剂的组织裂解液提取肝组织蛋白,用紫外分光光度计测定蛋白浓度。取100ug蛋白经⒓%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,转移到聚偏二氟乙烯膜,5%脱脂奶粉封闭后,分别与小鼠OPN(1∶500)及TGFβ1抗体(1∶200)(购自美国SantaCruz公司)反应后与相应的辣根过氧化物酶标记的免疫球蛋白G抗体(1∶20000)进行免疫反应,化学发光显色,胶片曝光显影。以β-肌动蛋白为内参照。用美国Kodak公司ID数码成像分析系统软件对Westemblot结果进行分析,结果以目的蛋白与β-肌动蛋白的积分吸光度比值表示。　　7.统计学方法:实验数据以均数±标准差表示。用SPSS13.0软件进行统计分析,多组样本均数间差异比较用单因素方差分析或Kruskal-WallisH检验,组间比较用最小显著差-t检验或mann-whitneyU检验。P<0.05为差异有统计学意义。　　结果　　1.各组实验小鼠一般情况、肝脏质量及肝指数的比较:对照组及四氯化碳组小鼠毛发有光泽,体态活泼,饮食及大小便正常;乙醇组、溶剂对照组及乙醇+四氯化碳组小鼠精神不振,饮食量减少,皮肤弹性差,毛发稀疏;乙醇+四氯化碳组3只小鼠在造模期间死亡,为四氯化碳注射至肠道所致。各组小鼠体质量、肝质量及肝指数(肝质量/体质量×100%)比较结果。　　2.各组实验小鼠肝脏形态学比较:造模8周,对照组及四氯化碳组小鼠肝脏呈红褐色,包膜光滑,质地中等。乙醇组及溶剂对照组小鼠肝脏为黄褐色,质地中等。乙醇+四氯化碳组小鼠肝脏色泽暗淡,质地偏硬。3.实验小鼠血清生物化学指标比较:乙醇+四氯化碳组小鼠血清ALT及AST水平显著高于其他各组,其ALT及AST水平随时间呈逐渐升高趋势。　　4.实验小鼠肝脏病理学改变及α-SMA表达变化:造模8周,对照组小鼠肝小叶结构清晰,肝细胞排列整齐、呈放射状,肝窦正常,细胞核结构清晰。四氯化碳组犭、鼠肝组织病变轻微,可见少量炎细胞浸润,窦周及汇管区少量纤维组织沉积。乙醇组及溶剂对照组小鼠肝细胞脂肪变性,以大泡性脂变为主。乙醇+四氯化碳组小鼠,造模第4周,肝细胞出现轻~中度脂肪变;第5周肝小叶内出现炎细胞浸润,窦周出现纤维组织沉积;第6周,炎细胞浸润程度加重,点、灶状肝细胞坏死形成,窦周纤维组织沉积增多;第7周,炎细胞浸润、肝细胞坏死及窦周纤维组织沉积进一步加重,中央静脉周围、汇管区胶原纤维向小叶内延伸;第8周,肝组织炎细胞浸润明显,可见片状肝细胞坏死,中央静脉周围、汇管区胶原纤维进一步向小叶内延伸,形成桥接纤维化。　　对照组、四氯化碳组、乙醇组及溶剂对照组小鼠肝组织表达少量α-SMA。乙醇+四氯化碳组小鼠肝组织α-SMA表达自第5周起进行性增加,主要表达于窦周活化肝星状细胞(HSC)及纤维组织沉积区域。　　5.乙醇+四氯化碳组小鼠肝组织OPN及TGFβ1表达变化:乙醇+四氯化碳组小鼠肝组织OPN表达水平于第5周起随造模时间进行性升高。TGFβ1表达量于第5周显著增加,之后持续高水平表达。　　讨论　　Lieber-Decarli乙醇液体饲料建立ALD动物模型,是以酪蛋白、橄榄油、玉米油、麦芽糊精、纤维素、矿物质、维生素等与乙醇混合制成液体饲料喂养,乙醇摄入量为16~24g·kg-1·d-1。单用Lieber-Decarli乙醇液体饲料喂养小鼠8周,可形成早期ALD模型,主要表现为肝细胞脂肪变性,无严重肝损伤形成。单用微量四氯化碳腹腔注射仅可引起ALT轻度升高,肝组织仅可见少量炎细胞浸润,窦周及汇管区少量纤维组织沉积。采用Lieber-Decarli乙醇液体饲料喂养联合微量四氯化碳腹腔注射建立小鼠酒精性肝纤维化模型,造模前4周用含4%乙醇Lieber-Decarli液体饲料喂养,形成ALD模型,在此基础上加用5%四氯化碳2ml/kg,2次/周,腹腔注射4周,可诱发酒精性肝损伤加重、肝纤维化形成。乙醇及其代谢产物导致肝细胞脂肪变,在此基础上发生氧化应激,进一步导致炎症及纤维化发生。四氯化碳致肝损伤是通过其代谢产生的自由基,如三氯甲基自由基、氯自由基等,导致脂质过氧化及氧化应激反应囿。因此,乙醇液体饲料喂养小鼠4周形成酒精性脂肪肝,加用小剂量四氯化碳,加重肝脂肪变基础上的氧化应激反应,可加速肝损伤进展,快速形成肝纤维化,肝损伤随造模时间进行性加重,肝组织病理学及血清生物化学改变均符合酒精性肝纤维化特征及其病变进展过程。本研究表明,Lieber-Decarli乙醇液体饲料联合微量四氯化碳腹腔注射可快速建立小鼠酒精性肝纤维化模型,造模方法简单易行,动物死亡率低,模型稳定性好,可作为酒精性肝纤维化研究的实验支撑模型。　　HSC活化是肝纤维化发生的中心环节。在本研究中,乙醇+四氯化碳组小鼠HSC活化标志α-SMA表达随时间进行性增加,提示HSC持续活化。HSC活化分为起始阶段及进展阶段。在HSC起始活化阶段,氧化应激、炎症反应刺激HSC活化,活化HSC合成并释放TGFβ1等促纤维化因子。在进展阶段,合成增加的TGFβ1又进一步激活HSC,促进肝纤维化不断进展。本研究中,促纤维化因子TGFβl在第5周表达显著增加,之后维持高水平表达。　　OPN介导乙醇导致的肝损伤发生,参与酒精性肝炎的进展。本研究结果显示,肝组织OPN表达自造模第5周开始增加,且表达量进行性增加。有研究报道,TGFβ诱导OPN表达,而OPN又可上调TGFβ1表达,并通过TGFβ1/Smad信号通路激活HSC。因此,在ALD进展过程中,OPN与TGFβ1形成正反馈调节,促进酒精性肝纤维化的发生及进展。　　参考文献　　1.唐袁婷,管小琴,刘莉. 茶多酚对酒精性肝病核因子-κB活性的调节作用[J].中华肝脏病杂志,2009,(4):301-305.doi:10.3760/cma.j.issn.1007-3418.2009.04.018.　　2.Lieber CS. Alcohol and liver:1994 update[J].Gastroenterology,1994.1085-1105.　　3.中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组. 酒精性肝病诊疗指南(2010年修订版)[J].中华肝脏病杂志,2010,(3):167-170.doi:10.3760/cma.j.issn.1007-3418.2010.03.003.　　4.Dominguez M,Rinc6n D,Abraldes JG. A new scoring system for prognostic stratification of patients with alcoholic hepatitis[J].Am J Gastroanterol,2008.2747-2756.　　5.Purohit V,Gao B,Song BJ. Molecular mechanisms of alcoholic fatty liver[J].Alcoholism:Clinical and Experimental Research,2009.191-205.　　6.Ismail RS,El-MegeidAA,Abdel-Moemin AR. Carbon tetrachlorideinduced liver disease in rats:the potential effect of supplement oils with vitamins E and C on the nutritional status[J].Ger Med Sci,2009.Doc05.　　7.Safadi R,Friedman SL. Hepatic fibrosis--role of hepatic stellate cell activation[J].Med Gan Med,2002.27.　　8.Banerjee A,Apte UM,Smith R. Higher neutrophil infiltration mediated by osteopontin is a likely contributing factor to the increased susceptibility of females to alcoholic liver disease[J].Journal of Pathology,2006.473-485.　　9.Banerjee A,Burghardt RC,Johnson GA. The temporal expression of osteopontin (SPP-l) in the rodent model of alcoholic steatohepatitis:a potential biomarker[J].Toxicologic Pathology,2006.373-384.　　10.Seth D,Gorrell MD,Cordoba S. Intrahepatic gene expression in human alcoholic hepatitis[J].Journal of Hepatology,2006.306-320.　　11.Ehnert S,Baur J,Schrnitt A. TGF-β1 as possible link between loss of bone mineral density and chronic inflammation[J].PLoS One,2010.e14073.　　12.Huang L,Wei MF,Feng JX. Abnormal activation of OPN inflammation pathway in livers of children with biliary atresia and relationship to hepatic fibrosis[J].European Journal of Pediatric Surgery,2008.224-229.