HLA测序技术在非亲缘性脐血移植应用价值探讨

　　作者：廖灿,杨昕,李焱,黄以宁,许遵鹏　　作者单位：广东省卫生厅“五个一工程”重大科研项目(卫科学1996-23);广州市科委重点攻关课题(99-Z-008-01);广州市卫生局重点攻关项目;广东省科委社会发展攻关项目(编号2003c34006)

　　【摘要】 1998年6月至2004年7月，广州脐血库向国内21家移植中心54例患者提供了非亲缘性异基因脐血。为了探讨非亲缘性脐血移植供/受者HLA等位基因及其亚型与脐血移植GVHD发生率的关系，对54例非亲缘性脐血移植病例中，半年后有反馈随访资料的48例，利用盐析或柱提法提取移植的非亲缘性脐血的DNA及移植病例的全血DNA，采用HLA-SBT方法分别对HLA-A、B、DRB1位点进行了高分辨分型，并与我库脐血收集常规采用的HLA-SSP(HLA-Sequencing specific primers)低分辨结果进行了比较分析。结果发现，HLA不合位点不多于2个和HLA不合位点不少于3个的病例GVHD的发生率具有统计学显著性差异(P<0.05)。在对HLA-A、B、DRB1等位基因高分辨单因素分型结果中，HLA-B和HLA-DRB1等位基因匹配全相合的病例GVHD发生率显著低于不完全相合病例GVHD的发生率(P=0.000，P=0.005)。结论：PCR-SBT技术在非亲缘性脐血移植HLA配型方面具有重要的临床应用价值。

　　【关键词】 非亲缘性脐血移植, HLA 配型,HLA测序技术,HLA-SBT,脐血

　　AbstractFrom June 1998 to July 2004, Guangzhou umbilical cord blood bank provided unrelated umbilical cord blood for 54 patients to more than 21 transplantation centers. HLA sequencing-based typing (SBT) was used to re-analyze the results of HLA antigens and alleles so as to investigate the relationship between HLA alleles and GVHD. The information about 48 out of 54 patients was obtained after 6 months of follow up. SBT was used to identify HLA-A, B, DRB1 alleles in 48 patients received the unrelated umbilical cord blood units, and the obtained results were compared with the results of HLA-SSP Low Resolution Typing. The results showed that the difference of GVHD incidence between less than 2 mismatched HLA sites and less than 3 sites was statistically significant (P<0.05). In the results from single factor analysis and high-resolution typing of HLA-A,B and DRB1 alleles, the mismatch between HLA-B and HLA-DRB1 alleles was found to be a significant factor for the occurence of GVHD. It is concluded that SBT plays an important role in umbilical cord blood transplantation, and the incidence of GVHD is higher in the transplantation with HLA-DRB1 alleles mismatching.

　　Key wordsunrelated umbilical cord blood transplantation; HLA mismatch; HLA sequencing; HLA sequencing based typing; umbilical cord blood

　　HLA高分辨分型技术不仅可以对HLA血清学配型起到积极的校正作用，对研究哪些HLA等位基因相合可以明显减弱GVHD，哪些等位基因不相合可以耐受等方面以及制定相对个体化的HLA配型策略都具有重要的临床应用价值。在骨髓造血干细胞移植中，HLA测序分型技术得到了广泛的应用和发展，在预防GVHD方面具有十分重要的意义。本研究采用以测序为基础的HLA分型技术(HLA-sequencing based typing HLA-SBT)对可随访的48例非亲缘性脐血移植病例HLA配型结果进行回顾性分析，以探讨HLA-A/B/DRB1等位基因匹配程度对非亲缘性脐血移植GVHD的影响。

　　材料和方法

　　脐血来源

　　脐血样本全部来自广州脐血库，脐血分离、冷冻、保存以及相关检测参考相关文献[2]。

　　移植供受体选择

　　54例非亲缘性脐血移植供受者样本及随访资料由国内21家移植中心提供，其中6例待随访，选择48例非亲缘性脐血移植病例进行回顾性分析，移植受者一般情况。

　　急性移植抗宿主病(aGVHD)的预防

　　48例移植病人均采用环孢霉素+甲基强的松龙方案预防aGVHD。

　　移植供/受体的DNA提取

　　移植供/受体DNA提取均采用G&T DNA提取试剂盒。

　　HLA-SSP分型

　　采用One Lambda公司的HLA-SSP分型试剂盒、PE9700PCR仪进行分型，采用One Lambda公司提供的HLA分型格局表判读结果。

　　HLA-SBT分型

　　应用ABI PRISM3100型测序仪进行分型。DNA 4 μl与PCR Mix(Forensic公司提供)16 μl混合，再加入金牌酶0.3 μl进行扩增反应。PCR条件如下：95℃ 10分钟;96℃ 20秒，60℃ 30秒， 72℃ 3分钟，36个循环;4℃ forever。取PCR产物5 μl在2%琼脂糖凝胶中电泳，确定是否扩增。向PCR产物中加入3 μl Exo SAP-IT,进行消化反应：37℃ 20分钟，80℃ 15分钟。消化后产物与Sequencing Mix 混合后，进行测序反应：96℃ 20秒，60℃ 2分钟，共25个循环。测序反应产物用NaOAc/EDTA去除多余的Sequencing Mix，并用100%及80% EtOH沉淀和纯化DNA。加入15 μl甲酰胺，置于ABT Prism3100测序仪中进行电泳。利用MatchTools及MT Navigator软件对电泳结果进行分析，得出HLA高分辨配型结果。

　　统计学分析

　　数据用SPSS 10.0统计软件包处理，行chi-square test分析。结果

　　PCR-SBT技术分型

　　48例非亲缘性脐血移植供受者HLA-A/B/DR采用PCR-SBT技术分型全部成功，SBT分型结果在低分辨水平(HLA基因型星号后2位数)与SSP分型结果完全一致。48例非亲缘性脐血移植供受者中，HLA等位基因6/6相合4例(8.3%)，5/6相合37例(77.1%)，4/6相合7例(14.6%);HLA等位基因亚型匹配5/6相合5例(10.4%)，4/6相合16例(33.3%)，3/6相合19例(39.6%)，2/6相合8例(16.7%)，未发现HLA等位基因亚型配型全相合病例。

　　SBT分型结果与GVHD发生率

　　48例非亲缘性脐血移植供/受者HLA等位基因分型结果中，HLA等位基因匹配6/6、5/6和4/6位点相合的移植受者GVHD分别发生4/4例、18/37例(48.6%)和5/7例(71.4%)，统计分析(chi-square test)，HLA匹配程度与GVHD发生率之间无统计学差异(P>0.05)。48例非亲缘性脐血移植受者中，植入33例，HLA等位基因亚型匹配5/6相合的2例移植病例均未发生GVHD，而4/6、3/6、2/6位点相合的移植病例GVHD发生率分别为54.5%(6/11)、91.7%(11/12)和75.0%(6/8)，统计分析(chi-square test)，HLA等位基因亚型不合位点不多于2个和HLA不合位点不少于3个的病例GVHD发生率具有统计学显著性差异(P<0.05)。在HLA-A等位基因亚型分型结果中，HLA-A等位基因亚型匹配0/2、1/2和2/2相合病例分别为11、28和9例，GVHD发生率分别为27.3%(3/11)、57.1%(16/28)和55.6%(5/9)，统计分析未发现HLA-A等位基因亚型匹配完全相合与不完全相合GVHD发生率具有统计学显著差异(P=0.061)。

　　在HLA-B等位基因亚型分型结果中，HLA-B等位基因亚型匹配0/2、1/2和2/2位点相合病例分别为11、33、4例，GVHD发生率分别为72.7%(8/11)、45.5%(15/33)和50%(2/4)，统计分析未发现HLA-B等位基因亚型匹配完全相合与不完全相合GVHD发生率具有统计学显著差异(P=0.000)(表2)。在HLA-DRB1等位基因亚型分型结果中，HLA-DRB1等位基因亚型匹配0/2、1/2和2/2位点相合病例分别为16、25和7个，其GVHD发生率分别为25%(4/16)、64.0%(16/25)和71.4%(5/7)。统计分析发现，HLA-DRB1等位基因亚型相合与否与GVHD发生率具有强相关性(P=0.003)(表2)。在38例HLA-DRB1等位基因全相合病例中，HLA-DRB1等位基因亚型匹配0/2、1/2和2/2位点相合病例分别为16、18和4个，GVHD发生率分别为25%(4/16)、61.1%(11/18)和50%(2/4);经统计学分析，比较HLA-DRB1等位基因亚型相合与不相合与GVHD发生率具有显著的统计学相关性(P=0.008)。

　　与GVHD相关的HLA等位基因亚型

　　在本回顾性研究中， HLA-A常见等位基因型为HLA-A*02、A*11和A*24，HLA-B常见等位基因型为HLA-B*15、B*40和B*46，HLA-DRB1常见等位基因型为HLA-DRB1*09、DRB1*12和DRB1*15。

　　剔除两点不合的样本，选择受体与供体一个位点相合而另一位点不合的病例，比较其GVHD发生率。HLA-A*02、A*11和A*24基因型分别有19例、21例和13例;HLA-B*15、B*40和B*46基因型分别有20例、13例和14例;HLA-DRB1*09、DRB1*12和DRB1*15基因型分别有11例、10例和13例(表3 )。经统计分析，HLA- A*11匹配与不匹配样本GVHD发生率分别为28.6%和64.3%，HLA-B各等位基因型匹配情况GVHD发生率未见明显差异，HLA-DRB1*12相合3例病例均未发生GVHD，而不相合的7例病例中有2例发生了GVHD。经统计分析(chi-square tests)HLA-A/B/DRB1各个等位基因匹配程度与GVHD发生率未见统计学相关性。

　　讨论

　　有研究表明，单个等位基因的不匹配(如白种人HLA-A*0201和HLA-A*0205亚型)可以引起严重的GVHD;也有报道DRB1等位基因不同与GVHD之间存在强相关性，而且DRB1不合与存活期缩短密切相关[2]。但是现在的研究表明，并不是所有等位基因不同与它的不相合是一致的，有些HLA等位基因的不相合是可以耐受的。在Nicholson等[3]对HLA-DP抗原的报道中，采用混合淋巴细胞培养(mixed lymphocyte culture,MLC)方法观察到最强烈的MLR反应与DPB1*0301和DPB1*0201有关，低MLR与DPB1*0401和DPB1*0402有关。提高HLA基因分型的分辨率，有助于寻找HLA完全相合的造血干细胞供者，也有助于针对供、受间HLA差异程度制定相应的防治策略。因此，有人提出界定供、受者HLA相合的标准。找出究竟哪些HLA基因座位(及其产物)在决定异基因造血干细胞移植预后中起关键作用，哪些HLA(等位基因)型别不相合为临床所容许，甚至可能对病例的预后有益[9]。本研究采用HLA-SBT方法对48例非亲缘性脐血移植供/受体HLA等位基因亚型进行分析，HLA低分辨配型结果中，HLA等位基因匹配程度与GVHD发生率无显著统计学相关性。对HLA-A、B、DRB1等位基因亚型分别进行统计分析发现，HLA-B和HLA-DRB1等位基因亚型完全相合和不相合的病例GVHD发生率具有非常显著的差别。需要特别指出的是，在本研究结果中，HLA不相合等位基因亚型不多于2个和HLA不相合位点不少于3个的病例GVHD的发生率差异具有统计学显著性(P<0.05)。以上结果从两方面给我们以提示：①HLA等位基因亚型水平的匹配对预防GVHD具有积极的作用;②一定存在某些HLA等位基因亚型，其相合与否对脐血移植病例来说在某种程度上是可以耐受的。从结果中我们可以看到，在HLA高分辨配型结果中，HLA-B和 HLA -DRB1等位基因亚型匹配与否与GVHD发生率具有强相关性(P=0.000，P=0.003)。HLA-A等位基因亚型匹配全相合病例GVHD发生率(27.3%)明显低于HLA匹配不全相合病例(59.4%)。这说明在非亲缘性脐血移植中，采用高分辨方法进行HLA-B和HLA-DRB1配型可以明显减弱GVHD的发生率。由于样本数较少，因此对以上结论仍然需要进行随访分析。从本结果中可以推测，HLA等位基因匹配与否对非亲缘性脐血移植者GVHD的发生具有重要作用，脐血移植者GVHD的发生率低，究其原因可能与脐血中免疫细胞的抗原性低有关。因此，非亲缘性脐血移植时对HLA采用高分辨分型是有必要的。本研究的另一个目的是试图寻找出与GVHD发生密切相关的HLA等位基因型，但由于病例数较少，无法对HLA所有等位基因型在非亲缘性脐血移植的作用进一步深入分析。我们选择了HLA-A/B/DRB1位点中比较常见的亚型进行统计分析，从统计结果中我们未发现与GVHD具有明显相关性的等位基因型。在本研究结果中，HLA-A*11等位基因相合病例的GVHD发生率(25%)明显低于不相合病例的GVHD发生率(58.3%)，由于病例数少，无法进一步分析HLA-A*11等位基因亚型对GVHD的影响。但我们可以设想，如果将来在移植前HLA复核时对HLA-A11采用HLA高分辨方法，可能会降低移植后GVHD发生率。虽然我们发现HLA-DRB1等位基因与GVHD发生率具有强相关性，但是我们未能找到与GVHD明显相关的等位基因亚型，其原因也是由于病例数太少的缘故。

　　致谢：感谢中山医科大学孙逸仙医院、广州市第一人民医院、广州市妇婴医院、北大人民医院、北京儿童医院、安徽省立医院、河南省肿瘤医院、南方医院、暨大华侨医院、第四军医大学西京医院、第二军医大学长海医院、广东省人民医院、四川大学华西医院、上海儿童医学中心、北大深圳医院、海口市人民医院、广州市第十二人民医院、佛山人民医院和广东省117医院给予的支持和协作。

　　【参考文献】

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　　3 Loiseau P, Esperou H, Busson M, et al. DPB1 disparities contri- bute to severe GVHD and reduced survival after unrelated donor bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant, 2002; 30: 497-502

　　4 杨文莉. HLA配型在异基因骨髓移植中的研究进展. 西安医科大学学报, 2000; 21: 611-614

　　5 Petersdorf EW, Anasetti C, Martin PJ, et al. Tissue typing in support of unrelated hematopoietic cell transplatation. Tissue Antigens， 2003; 61:1-11

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　　7 Mickelson EM, Petersdorf E, Anasetti C, et al. HLA matching in hematopoietic cell transplantation. Hum Immunol, 2000; 61: 92-100

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　　9 Papassavas AC, Barnardo MC, Bunce M, et al. Is there MHC class Ⅱrestriction of the response to MHC class Ⅰin transplantation patients? Transplantation, 2002; 73: 642-651