血小板及功能检测进展

　　作者：朱桂峰,曾莎　　作者单位：聊城市人民医院，山东 聊城 252000

　　【关键词】 血小板,血小板功能,检测

　　正常血循环中血小板在静息状态下呈双凸碟形，由细胞膜包裹着含少量颗粒的物质，平均直径2.4 μm，平均容积7.2 fl,寿命7 d～10 d。

　　1 血小板数量检查

　　1.1 目测计数法

　　将血液用适当的稀释液作一定量稀释，混匀后充入计数池内，在显微镜下计数一定体积内的血小板数量，经过换算得出每升血液中血小板数。

　　1.2 细胞分析仪计数法

　　1.2.1 电阻抗法

　　血小板通过小孔引起电阻变化，产生的脉冲经数字化后，根据不同的阈值，计算机分别给出血小板数目。

　　1.2.2 光散射法

　　折射率与细胞内容物有关，血小板有别于红细胞等其它非血小板颗粒，其折射率较低，通过低角度光散射即可与红细胞区别。

　　2 血小板形态、结构检查

　　瑞氏染色，显微镜观察;MPV检查，应用全自动血细胞计数仪检测。

　　3 血小板功能检查

　　3.1 血块收缩试验(CRT)

　　血块收缩时有相应的血清析出，计算占原有血量的百分数。

　　3.2 血小板粘附试验

　　一定量血液与一定表面积的异物接触后，即有相当数目的血板粘附于异物表面上，测定接触面后血小板数之差，可求出占血小板总数的百分率。

　　3.3 血小板聚集试验

　　血小板聚集是血小板的主要功能之一，主要有比浊法、剪切诱导血小板聚集测定法、散射性粒子检测法、全血电阻抗法、血小板计数法、微量反应板法等。

　　3.3.1 比浊法

　　在特定的搅拦条件下，在富含血小板血浆中加入诱导剂后，由于血小板发生聚集，悬液的浊度随之下降，根据描记曲线可以计算血小板聚集程度及速度[1]。

　　3.3.2 剪切诱导测定法

　　不加诱聚剂，血小板在高剪切力环境下血小板聚集，根据比浊法的原理采用旋转式铁板流体测定仪，仪器绘制成聚集曲线，以观察体外血小板聚集变化。

　　3.3.3 散射性粒子检测法

　　该技术是将半导体激光(波长675 m)通过聚光镜折射成宽度约50 μm的带状光束，照射到装有PRP的比色杯，采用显微镜的接物镜，使血小板发出的散射局限在一个狭小的范围内测定，通过测得聚集块的大小及生成数量这两个指标来评价其凝聚功能。

　　3.3.4 全血电阻抗法

　　使用全血血小板聚集仪，通过记录浸泡于血液电极间的微小电流或电阻变化而形成的聚集曲线，以观察体外血小板聚集变化。

　　4 流式细胞术检测血小板活化的方法及应用

　　血小板活化是止血和血栓形成的主要原因[1]，检测血小板活化值，是对反映血栓形成的诊断、预防、治疗监测的重要手段[2]。

　　4.1 三色流式分析方法检测血小板活化

　　三色流式分析法是在常规FCM检测基础上发展起来的一种多参数分析，可以更全面、更系统的获得血小板相关信息。血小板活化试剂：1PAC1FITC抗体：IgM型，与活化的GP b/a复合物结合，是早期血小板活化标志物;2CD62pPE抗体：IgM型，血小板活化时表面的CD65p结合，是血小板活化后期的标志物;3CD61PerCP:IgG1型，特异的泛血小板表面标记，既与活化血小板结合，也与未活化血小板结合。

　　4.2 细胞内钙离子测定

　　FCM还能检测反映活化血小板功能的非免疫性指标。由于血小板活化时细胞内的钙离子浓度发生很大变化，借助于Ca2+敏感荧光探针，用FCM测定钙离子浓度，可以作为活化血小板监测的非免疫性指标。

　　4.3 阿的平检测活化血小板的释放功能

　　阿的平能进入血小板致密颗粒，血小板活化时用FCM可以通过检测荧光强度来显示，因此，也可以作为一个非免疫性检测指标。

　　5 血小板微颗粒的检测

　　血小板微颗粒(PMP)是血小板在不同刺激因素作用下细胞膜向外伸展变形的细胞膜部分以出芽方式形成小泡或伪足脱落进入微循环而形成的细小微粒。

　　由于PMP体积极小，因此传统检测方法必须借助电镜、共聚焦显微镜、荧光显微镜等进行肉眼观察，或是将分离后的PMP用电泳转移到硝酸纤维膜上，以Westernblot方法免疫标记，再经扫描进行半定量分析。这些传统检测方法不仅操作繁琐，难以定量，而且其分辨率和精密度难以满足诊断要求，使得PMP的检测受到很大限制。

　　FCM测定法可利用PMP表面抗原荧光抗体进一步对其加以区别，根据其前向角散射光(FS)及荧光强度(FI)进行定量。由于PMPs直径约为0.031 mm，常规方法的灵敏度和分辨率不够，使得PMPs的检测受到限制。发展的FCM内参定位法检测PMPs血小板微粒，成功的解决了上述问题，使FCM在PMPs测定及血小板活化监测方面得以推广，有利于实验结果的室间比较和检测方法的标准化。

　　6 血小板抗体

　　血小板抗体可以引起多种临床疾病或症状，如同种或自身免疫性血小板减少症，输血后紫癜，血小板输注无效等。血小板抗体的检测方法，已报道有多种[3]，如血小板免疫荧光试验、固相红细胞粘附试验(SPRCA)、单克隆抗体特异性血小板抗原固定术(MAIPA)、改进的抗原捕获酶联免疫吸附试验(MACE)、流式细胞术法等。

　　血小板相关抗体主要是PAIgG,还有PAIgM和PAIgA，有资料证明，IgM具有较高的结合价和凝集能力，只需一个分子IgM抗体即足以激活补体，在决定血小板寿命中很重要[4]。造成血小板输注无效的主要原因之一是血小板表面上众多复杂相关抗原及自身特有抗原与相应抗体的同种免疫作用。采用SPISA法(供者血小板与受者血清反应)可为患者选择配合性血小板输注，可提高疗效[5]，也可选择最不配合的血小板输注在特殊治疗上[6]。

　　7 网织血小板检测 网织血小板代表由骨髓巨核细胞释放入外周血最新生成的血小板。在失血或血小板破坏的情况下，网织血小板水平明显增高[7]，它与网织红细胞一样是反应骨髓血小板状态极有价值的指标之一。外周血中网织血小板的比例和数量是反映体内血小板生成能力极有价值的指标[8]。随着流式细胞仪的使用，通过CD41单抗的特异性标记以及流动计数10 000个血小板准确而又快速地检测出含RNA的血小板。网织血小板检测的精确度也大大提高。

　　8 血小板血型

　　血小板表面具有复杂的血型抗原，这些抗原是由遗传决定的，通常同种异体抗原分为两类。血小板和其它细胞共有的抗原：ABO系统的抗HLA类的抗原。血小板同种异体抗原主要能引起五种临床综合症:胎儿及新生儿同种免疫血小板减少症、输血后紫癜、血小板输血无能症、被动免疫血小板减少症及移植相关的同种免疫血小板减少症。血小板同种异体抗原定型技术主要有：血清学定型、基因定型，分子基因方法便于同种异体抗原多态性的定型。

　　综上所述，出凝血疾病的病因检测，除应注意常规的血小板计数及功能检测外还应重视新指标的检查，某些新的检测指标更有利于出凝血疾病的病因检测。

　　【参考文献】

　　[1]王振义，李家增，阮长耿.血栓与止血基础理论与临床[M].第2版.上海：上海科学技术出版社，1996：378379.

　　[2]孙芾，王厚芳.流式细胞术的发展和临床应用[J].中华医学检验杂志，1999，22：385386.

　　[3]HelmbergW,FolschB,WagnerT,et al.Detection and differentiation of plateletspecificar tibodies by flcw cytometry:thebead-mediatedplatelet assay[J].Transfusion,1997,37:502506.

　　[4]Nel JD. Platelet-bound IgM in auto immunethrombocy to penia[J].Blood,1983，61:119.

　　[5]刘达庄，陆萍，王健莲.血小板同种抗体与输血效果[J].中国输血杂志，1993，6(2)：76.

　　[6]丁子清，胡兆平，陈家萍，等.VP-16偶联血小板治疗难治型ITP的研究[J].中国输血杂志，1991，4(3)：115.

　　[7]Richards EM，Jestice HK,Madendra P,et al.Bone Marrow Transplantation,1996,17:1029.

　　[8]余自强，翟志敏.网织血小板检测在血小板减少症中的意义[J].临床血液学杂志，2001，14(3)：110.