异基因造血干细胞移植中NK细胞的作用

　　作者：李晓红,高春记　　作者单位：解放军总医院血液科，北京 100853

　　【摘要】异基因造血干细胞移植后，供者细胞可产生强大而持久的免疫治疗功效，其中异源反应性NK细胞活性是T细胞异源反应活性以外的，具有显著抗肿瘤/白血病活性的自然免疫现象，并逐渐受到人们的重视。已证实，NK细胞通过其受体与靶细胞MHC分子特异性的识别机制参与移植物抗白血病(GVL)作用并影响移植物抗宿主病(GVHD)的发生。异基因造血干细胞移植后异源反应性NK细胞输注已从动物实验逐渐应用于临床。本文就NK细胞异源反应性及其在异基因造血干细胞移植中的作用进行综述。

　　【关键词】 异基因造血干细胞移植,NK细胞,移植物抗白血病,移植物抗宿主病

　　Abstract After allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT)，the donor cells present a profound immunization therapy efficiency. Among these effector cells，allo-reactivity natural killer (NK) cell activation are concerned with the graft-versus-host disease (GVHD) and graft-versus-leukemia (GVL) effect . As known，GVHD is primarily a T-cell-mediated event but not initiated by NK cells. NK cells may significantly enhance GVL immune response by using an integration of activating and inhibitory receptors. Allo-reactivitive NK cell infusion after allo-HSCT already transits from experiments to clinic. In this review the background on NK cells，and their clinical roles in Allo-HSCT were summarized.

　　Key words allogeneic hematopoietic stem cell transplantation; natural killer cell; graft-versus-leukemia; graft-versus-host disease

　　异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是治疗多种恶性病及一些非恶性病的有效方法，尤其在治疗急性白血病方面，可使50%患者长期无病生存。研究发现，异基因造血干细胞移植后，供者免疫系统在受者体内的重建可产生移植物抗白血病(graft versus leukemia，GVL)作用，但也产生危及患者生命的移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)及迟发的免疫功能障碍。随着对NK细胞功能及活化机制的了解，其在allo-HSCT后造血重建及免疫重建中的作用越来越受到重视。许多的动物实验和临床观察均提示allo-HSCT后，供者NK细胞的异源反应活性通过促进植入、阻止T细胞介导的GVHD、攻击宿主白血病细胞发挥GVL效应。上述现象最初发现于单倍不相合移植，而后研究提示在HLA相合有血缘关系及非血缘关系供者移植中均有体现[1，2]。但最近国外也有研究发现，KIR-配体不相合引起的NK细胞异源反应性与移植相关死亡率(transplantation related mortality，TRM)升高及总存活率下降有关[3，4]，故在这方面的研究仍是热点，存在许多争议。本文就NK细胞异源反应性的形成机制、NK细胞在allo-HSCT中的作用等问题的研究新进展综述如下。

　　NK细胞群

　　NK细胞及来源

　　NK细胞是淋巴细胞谱系中不同于T、B淋巴细胞的一类大颗粒淋巴细胞，其代表性表型为CD3-、CD56+、CD16+。它是天然免疫系统的主要效应细胞，无需抗原预先致敏，与靶细胞混合后4小时内即可发挥杀伤作用，表现为速发效应，因此位于机体抵御肿瘤和病毒感染的第一道防线，同时又能通过早期分泌多种细胞因子和趋化因子来调节获得性免疫，故也是连接天然免疫与获得性免疫的桥梁[5，6]，在机体免疫调节、造血调控、抗肿瘤和抗感染等方面发挥着重要的作用。Cooper等[7]根据NK细胞上CD56分子表达密度的不同将NK细胞分为CD56bright和CD56dim两个亚群，在正常人外周血单个核细胞主要参与NK细胞细胞毒作用。NK细胞来源于骨髓CD34+造血干细胞，其发育、成熟需要骨髓微环境包括骨髓基质及其来源的细胞因子。NK细胞与T细胞来自同一祖细胞，这种分化上的亲缘性可能解释了NK细胞活化也受协同刺激信号的影响，及胞内信号传导通路与T细胞极为相似等现象。但与T细胞不同，NK细胞的发育成熟不依赖于胸腺，在骨髓微环境中，IL15与其配体C-kit(KL)和flt-3(FL)的协同作用是NK细胞发育的关键生理调节因素，在其最初发育期，NK祖细胞在早期基质细胞活化生长因子KL、FL作用下发育为NK细胞前体，该前体细胞在IL-15作用下发育成熟为功能性NK细胞。

　　NK细胞受体及杀伤活性调节

　　NK细胞功能的发挥主要依赖于其识别靶细胞的受体。它有两种受体：一类是激发NK细胞杀伤作用的杀伤细胞活化受体(killer activatory receptor，KAR)，如CD94/NKG2C、NKP-P1、KIR-3Dshort;另一类是抑制NK细胞杀伤作用的杀伤细胞抑制受体(killer inhibitory receptor，KIR)，如CD94/NKG2A、KIR-3Dlong。按分子结构，也可将与NK细胞杀伤作用相关的受体分为免疫球蛋白样受体(immunoglobulin-like receptor)和凝集素样受体(lectin-like receptor)。一般认为，NK细胞可同时表达活化和抑制受体，其杀伤功能取决于表面抑制性受体与活化受体所传递信号的综合。抑制性受体KIR的配体为MHC-Ⅰ类分子。由于抑制性受体与其配体结合的亲和力大于活化受体，因此通常以抑制性信号占优势。正常情况下，机体组织细胞表面表达自身MHC-Ⅰ类分子，NK细胞KIR识别自身MHC-Ⅰ类分子，产生杀伤抑制信号，该信号在胞内起主导作用，能阻断杀伤信号的传递，表现为自身组织细胞不被破坏。只有当靶细胞表面MHC-Ⅰ类分子表达降低、丢失或发生变异(如细胞发生恶性转化、病毒感染等)时，NK细胞才能活化并启动杀伤作用，此即NK细胞的丢失自我(missing self)识别模式，即“杀伤自身MHC抗原减少或消失的细胞”[8]。

　　异基因造血干细胞移植中的NK细胞作用

　　NK细胞的“有利作用”

　　在异基因造血干细胞移植中，根据上述“丢失自我机制”，大部分情况下供者NK细胞KIR与受者靶细胞MHC分子的特异性识别表现为KIR-配体不相合性(少数情况下供受者KIR基因可能相合)，可激活供者NK细胞，产生异源反应性NK细胞。KIR-配体不相容性与供者NK细胞的异源反应性密切相关。研究证实，此机制已参与移植物的植入、GVL作用及GVHD的发生，并对异基因造血干细胞移植产生有利影响，现分述如下。

　　NK 细胞与移植物的植入

　　无论供者、受者NK细胞都对移植物的植入有一定影响。受者方面，尽管在鼠类的研究显示了抗放射性宿主NK细胞在抵抗骨髓植入中的重要性，但临床干细胞移植中宿主NK细胞介导的抗植入现象却很有限。移植前抑制受者免疫的强化处理方案及大量植入的干细胞数量可基本抵消受者NK细胞的抗植入作用。供者方面，越来越多的研究发现，allo-HSCT过程中供者异源反应性NK细胞可主动攻击宿主细胞，辅助供者干细胞成功植入。供者来源的NK细胞(无论是原本存在于移植物中的还是由植入干细胞新分化发育的)都对促进植入有重要作用。当供受者KIR不相合引发供者NK细胞异源反应性时，供者NK 细胞通过识别杀伤受者残留淋巴细胞和造血细胞而发挥强有力的促植入作用[9]。Peters等[10]的临床研究发现，5例高危急性白血病患者经单倍相合异基因造血干细胞移植后，输注纯化的供者NK细胞可增加稳定嵌合体的形成，进一步证实了供者NK细胞可巩固移植物植入。

　　NK细胞与GVHD

　　GVHD的发生主要由T细胞介导。这一过程始于供者T细胞伴随造血干细胞进入受者体内与受者抗原相遇。启动GVHD的关键的第一步是抗原呈递细胞(APC)向供者CD8+T细胞呈递主要和次要组织相容性抗原。NK细胞并不引发GVHD。研究发现，在鼠类供受者H-2相合但仍可发挥供者NK细胞异源反应性的干细胞移植实验中，无GVHD出现，而且给受体鼠大剂量输注不相合NK细胞克隆也不引发GVHD[11]。进一步在临床移植观察中，单倍相合的allo-HSCT后的供者NK细胞输注是可耐受的，并不导致GVHD。然而，由于GVHD诱发的细胞表面分子上调并通过NKG2D配体激活NK细胞，使得NK细胞可能促进靶细胞的损伤。另一方面，在HLA不相合干细胞移植中，供者NK细胞可通过表达LFA-1(淋巴细胞功能相关抗原1，是一种黏附分子，介导NK细胞与靶细胞结合)的造血系统特异靶细胞减轻GVHD。供者异源反应性NK细胞可于输注后数小时之内杀灭受者淋巴细胞、骨髓细胞及APC[11]。理论上APC为启动GVHD所需，故输注异源反应性NK细胞应可以减轻GVHD。临床研究数据支持这一假说：在单倍相合和非亲缘供者异基因造血干细胞移植中，存在NK细胞异源反应性的供-受者的GVHD发生率确实低于KIR相合者[12]。

　　NK细胞与GVL

　　在相同预处理条件下，allo-HSCT治疗恶性血液病的复发率低于自体造血干细胞移植。目前认为，其主要原因是异源反应性NK细胞、T细胞所产生的GVL效应[13]。NK 细胞与T细胞的异体反应性的区别显示，在HLA不相合移植中T细胞是GVHD的主要效应细胞，而NK细胞在移植物植入及GVL中起主要作用。前面已提到造血细胞对NK细胞的攻击很敏感，根据“丢失自我”识别模式，当NK细胞遇到KIR不相容的白血病细胞(靶细胞)时，就会显示出强大的细胞毒作用，而在KIR相合或自体造血干细胞移植中无此作用。将人类异源反应性NK细胞克隆输注到已植入人AML细胞转染性NOD/SCID小鼠D的实验研究发现：未治疗组及给予人无异源反应性NK细胞克隆组小鼠均于3周内死亡;而输入人异源反应性NK细胞组(即使输入的细胞数很少)，这些异源反应性NK细胞即可清除白血病细胞并使小鼠存活120天。动物实验及临床移植均证实由KIR不相合产生的异源反应性NK细胞是allo-HSCT预后的有利因素。

　　NK细胞的“不利影响”

　　如前所述，异源反应性NK细胞在allo-HSCT中有许多有利作用，目前这方面的理论研究及临床实践很多。但近期一些临床研究也得出一些KIR-配体不相合引起的异源反应性NK细胞对移植的不良影响。一方面，Ruggeri等[14]最近仍报道单倍相合造血干细胞移植后，异源反应活性NK细胞介导的供者抗受者异源性反应可减少AML患者复发危险，改善植入，减轻GVHD;并进一步提出临床应用中可通过供者及受者高分辨HLA基因配型，积极鉴定供者KIR基因，甚至在一些病例中根据供者NK细胞克隆功能评价选择单倍体供者，均可能有助于增强巩固供者抗受者的NK细胞异源反应性。但另一方面，Nguyen等[15]在10例AML经单倍相合造血干细胞移植患者中研究移植后的NK细胞重建，发现尽管10例中8例KIR配体不相合，10例AML患者单倍相合造血干细胞移植后NK细胞恢复中未观察到GVL效应。且干细胞移植后产生的NK细胞表现出不成熟的表型：细胞毒性CD3(-) CD56(dim)亚型很少，表达KIR、NKp30 减少，而表达CD94/NKG2A增加。这些结果揭示，单倍相合干细胞移植后产生的NK 细胞 被阻滞在一种具有特殊表型特点的非成熟阶段，功能不全，对免疫应答及抑制恢复有潜在影响。不成熟的NK细胞，及NKG2A的抑制作用减轻了GVL效应。同时，Malmberg等[3]，Schaffer等[4]在190例非亲缘供者造血干细胞移植中(KIR-配体不相合者167例，相合者23例)的最新研究发现，KIR-配体不相合引起的NK细胞异源反应性与TRM升高及总存活率下降有关。这主要由严重感染引起，考虑由KIR-配体不相合引起的同种异源反应性NK细胞的存在可能潜在地阻碍了机体对移植后早期感染的有效免疫。目前看来，allo-HSCT后的造血重建与免疫重建非常复杂，其中NK细胞作用有待进一步探讨。伴随供者干细胞进入受者体内的成熟NK细胞与由供者干细胞在受者体内逐渐发育分化而来的NK细胞对移植后免疫是否有不同的影响，仍需进一步研究;同时，KIR-配体不相合在移植中的意义有待进一步评价。

　　临床展望

　　从临床应用来说，虽然对于异源反应性NK细胞在allo-HSCT中的作用仍存在许多争议，但根据其有利的作用，供者NK细胞输注已从实验动物研究开始逐渐用于临床，目前报道未出现明显不良反应[10]。对临床治疗思路有几方面启示： 首先，移植前进行供受者HLA配型并结合KIR基因鉴定，尽可能为选择更合适的供者提供依据;其次，NK细胞可加速APC从受者骨髓、脾脏等部位的清除，减轻GVHD，因而可无需使用针对T细胞的免疫抑制处理方法，这为降低GVHD发生设计了另类策略[16，17]。再次，联合供者异源反应性NK细胞输注，有望降低异基因造血干细胞预处理强度，更进一步扩大适应症范围，使得高龄及临床状况差的患者也得到治疗机会。

　　结语

　　随着对移植免疫学及NK细胞生物学效应产生机制的深入研究，人们对NK细胞在allo-HSCT中的作用逐渐了解。NK细胞受体(NKR)中KIR与配体(MHC-Ⅰ类分子)的不相合是激活NK细胞杀伤作用、在异基因移植中产生异源反应性NK细胞的关键，因此这也成为目前研究的热点。大部分研究结果显示，异源反应性NK细胞有利于异基因造血干细胞植入，可减少GVHD，并发挥GVL作用。但对移植后免疫重建及患者总生存率的影响研究较少，临床病例也缺乏长期观察，故这些方面还有待进一步阐明。在临床治疗中，纯化供者NK细胞的输注已在干细胞移植及恶性实体瘤生物治疗等方面取得了良好效果，并对干细胞移植治疗策略产生了重大影响。如何更好的发挥NK细胞功能，将是allo-HSCT治疗及肿瘤免疫治疗的研究重点。

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