慢性淋巴细胞白血病的遗传学异常及其临床意义

　　作者：梁光林,吴炜,夏瑞祥,夏瑞祥　　作者单位：合肥 安徽医科大学第一附属医院血液科

　　【关键词】 白血病,淋巴细胞,慢性,原位杂交,荧光,细胞遗传学

　　慢性淋巴细胞白血病(CLL)是一种B淋巴细胞肿瘤，免疫分型通常表达CD5、CD19、CD23，SmIg弱表达，CD22弱表达，不表达CD79b和FMCT。其临床表现和转归具有明显的异质性，一些患者生存期可长达30年，早期没有任何症状，数年之后才出现淋巴结、肝脾或其他器官的受累。而有些患者在短短几个月内即出现疾病进展，甚至转化为侵袭性淋巴瘤和白血病，不过后者只占全部CLL的一小部分[1]。目前CLL的治疗有多种方案可供选择，如联合化疗、免疫治疗以及造血干细胞移植。对于预后较好的患者，积极的化疗并不能延长其生存时间，反而因过度的治疗给患者的身体造成一定的损害。而预后差的患者如未及时进行治疗干预，疾病会较快进展、恶化，甚至死亡。如何能在疾病早期对CLL患者的预后进行准确的评估，以指导临床医师采取合适的治疗，这个问题一直是CLL治疗亟待解决的问题。

　　长期以来CLL的预后评估主要根据Rai和Binet临床分期系统，但是这两个分期系统都主要以血红蛋白、血小板数量，疾病累及的淋巴结区进行划分，未能更深入的从CLL疾病本质对其进行评估，不能在发病的早期阶段准确预测疾病演变情况。近几年研究发现大部分CLL患者都伴有特殊的细胞遗传学改变，根据细胞遗传学异常可以更加准确地评估患者的预后以及治疗反应情况。

　　1 CLL常见遗传学异常

　　1.1 13q缺失 13q缺失是CLL最常见的染色体异常，如果仅有13q-单一异常，通常预示疾病进展较慢，生存期较长，平均生存时间为133个月，不需要过度的治疗干预。13q缺失通常涉及13号染色体长臂的1区4带，但是具体缺失范围目前仍未明确。一些研究表明，缺失区域可能只为13q14，也可能伴有更大片段的缺失[2]。视网膜母细胞瘤基因(RB1)位于13q14.1-14.2，del(13q14)可造成该基因的缺失，早期认为RB1是CLL的候选抑癌基因。以后研究发现，纯合性的RB1缺失很少见，且13q14缺失的断裂点在位于RB1基因远端D13S25 的位置，推测del(13q14)的关键基因可能位于RB1基因远端的D13S25和D13S19之间。此外也有研究显示CLL染色体序列缺失仅仅累及到一些重要的基因，Calin等[3] 在13q-的CLL患者中发现有两种micro-RNA(miR15和 miR16)表达下调甚至缺失，而这两种micro-RNA可以通过RNA干扰作用下调远处抗凋亡基因BCL-2的表达，可能对CLL疾病进展有影响。

　　1.2 12三体 +12是最早发现的B-CLL染色体异常，其发生率为10%～35%，通常伴有其他核型异常。其生存期与正常核型CLL患者无显著差异，约为114个月。但有研究表明，在12q区域发现一组已扩增活化的基因，这组基因有可能会加速疾病的进展。

　　1.3 17p13缺失 17p13缺失是CLL预后较差的核型异常，可能涉及到17号染色体整个短臂，从而会影响到该区域p53基因的正常功能[4]。p53是重要的抑癌基因，其编码的基因产物P53蛋白是调节细胞凋亡的关键分子，有“分子警察”之称。P53蛋白的分子监视功能出现缺陷，容易使有DNA分子异常的细胞逃过监视而存活，异常的基因逐渐累积，最终可导致肿瘤的发生。具有17p13缺失的CLL患者多数预后差，疾病进展较早，且对联合化疗不敏感，多数生存期仅为32个月。因为多数化疗方案都含有嘌呤类似物的细胞毒药物，其发挥作用主要依赖p53介导的促凋亡机制[5]。即使是对多数CLL治疗效果较好的药物如氟达拉滨和利妥昔单抗，亦未见较好的治疗效果。但这有可能被阿伦单抗克服，尤其是联合应用高剂量的甾体类药物，疗效会更好[6]。

　　1.4 11q22.3缺失 11q22.3缺失常规染色体核型分析检出率小于5%，应用FISH技术可以提高到20%。DNA片段丢失导致位于该区域运动性毛细血管扩张症突变(ATM)基因缺失，其编码的ATM蛋白通过P53蛋白介导的DNA修复和细胞凋亡途径，在DNA损伤识别、修复以及细胞周期调节、细胞凋亡中发挥作用，所以ATM基因缺失引起的细胞凋亡缺陷与P53基因异常类似[7]。11q22.3缺失与17p13缺失的CLL一样预后较差，通常生存时间为79个月，联合化疗效果较差，但联合利妥昔单抗、喷司他丁和环磷酰胺在11q、异常的CLL中取得了较好的治疗效果[8]。

　　1.5 少见的细胞遗传学改变 CLL常见的核型异常对疾病的预后价值已通过大量的病例进行回顾性分析证明，但尚有其他少见的染色体异常，由于其发生率较低，无法进行统计分析。如6q-、2p+、3q+、8q+等。CLL遗传学异常可单独发生，也可重叠发生，如13q、11q、17p、6q缺失和12三体，但某些异常可能是继发改变如2p+、3q+、8q+，因为从未发现这些遗传学异常独立存在，只在复杂异常核型中发现。此外还有约20%的CLL病例，经过目前尚有的检测手段未发现染色体异常，这部分病例通常情况下预后较好，但比13q-单一异常者预后差。

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　　2 遗传学检测方法

　　2.1 染色体显带技术(CBA) 传统的遗传学分析主要应用染色体显带技术(CBA)，尽管CBA在其他白血病的分类和预后意义已被证实，但由于CLL细胞体外增殖活性低下，即使在B细胞分裂素的作用下，增殖仍不明显。由于不能获得足够的分裂相，或者由于体外中期分裂相的质量差，仅40%～69%的病例可以检出克隆性畸变。Buhmannn等研究证实，CLL细胞在体外的增殖可通过B细胞分裂素CD40配体(CD40L)增强。CD40L刺激能诱导93%的病例产生中期分裂相，而传统的方法仅78%。更重要的是CD40L刺激后能够检出89%的病例有畸变，而传统的细胞遗传学方法仅22%[9]。但因其需要较大的工作量，并需要细胞共培养体系，CD40L增强细胞遗传学的方法很难应用于常规诊断。Haferlach等在以后的研究中联合应用具有免疫刺激作用的CpGguar寡核苷酸DSP30和IL-2，二者已被报道能在体外有效促进CLL细胞周期进程[10]。该方法使132例中的125例(94.7%)被成功地刺激产生中期分裂相，这125例中的101例(80.8%)检出染色体异常[11]。因此CBA是一项强有力的检测技术。

　　2.2 荧光原位杂交技术(FISH) 荧光原位杂交(FISH)是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20 世纪80 年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的1种非放射性原位杂交技术。基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。FISH检测技术克服了常规核型分析的局限性，使人们可对处于细胞间期的生物标本进行染色体结构与数目异常的研究。应用FISH检测技术能大大提高CLL患者染色体异常检出率，可以发现高达80%的CLL患者伴有遗传学异常，具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点。Glassman等采用间期FISH检测100例CLL的染色体异常，发现64%的患者至少1种异常，其中以del(13q14)最常见(40%)，其次为17p-(12%)、+12(11%)和11q-(11%)[12]。

　　在血液系统恶性肿瘤中，CBA检测可以提供重要的遗传学和预后方面的信息，与其他遗传学检测技术相比，其主要的优点是可以全面观察显微镜下的可见核型异常。但前提条件是细胞需在体外进行分裂，由于CLL细胞体外有丝分裂活性低，因此既往CLL的CBA检测成功率不高，然而在加入了DSP30和IL-2后提高了有丝分裂指数，异常的检出率明显提高，Decker等应用该种方法对132例CLL中的125例(94.7%)成功进行了CBA检测，101例(80.8%)检出了核型异常，与FISH检出的异常率相当。但加入的有丝分裂刺激剂有诱导产生选择偏倚的可能。但总体而言其好处大于坏处。FISH检测技术是一种新兴的遗传学检测技术，不需要细胞进行体外分裂，可以同时对有丝分裂中期和间期细胞进行检测，操作步骤简单，检测信号强，特异性较高，可以进行多重染色，CLL检出率高达80%[13]。然而FISH 的局限性在于其仅能对已知探针的基因位点进行分析，FISH分析低估了CLL患者核型异常的复杂性和异质性，如应用FISH进行畸变的筛查，需要大量的探针，检测费用较高。多重荧光原位杂交(M-FISH)，该技术将FISH的敏感性和特异性与CBA结合起来，使得染色体异常的检出率大大提高。M-FISH与FISH的联合应用，可以确认CBA分析中发现的复杂染色体核型异常，并纠正CBA分析中漏检及误检的异常，但费用较高，不适于普及筛查。

　　3 慢性淋巴细胞白血病的治疗

　　慢性淋巴细胞白血病是淋巴系统恶性肿瘤，其临床表现和转归具有明显的异质性，故其治疗也应进行个体化治疗。对于Rinet A期的患者，无预后不良的遗传学改变，可仅予以临床观察，暂不予治疗，早期应用与不应用苯丁酸氮芥的10年生存率无显著差异，故不推荐早期应用。目前氟达拉滨已广泛作为CLL治疗的一线治疗用药，氟达拉滨是一种氟化腺嘌呤类似物，为周期性非特异性药物，对分裂期和静止期的淋巴细胞都有选择性免疫抑制作用，可引起DNA 核心部位的染色体断裂，诱导细胞凋亡[14]。多项研究表明单用氟达拉滨其CR率均高于20% ，其疗效甚至高于CHOP或CVP方案。氟达拉滨联合环磷酰胺疗效优于单用氟达拉滨。德国CLL研究组CLL4的结果显示，氟达拉滨联合环磷酰胺疗效与单用氟达拉滨相比具有更高的CR率(24%vs 7%)，PR率(95%vs 83%)以及更长的无病生存期(48个月vs20个月)。但氟达拉滨对伴有17p13缺失的CLL无效，对ATM缺失的病例效果亦较差。

　　对于难治性的CLL病例，单用氟达拉滨效果较差，需联合化疗，如阿伦单抗(CD52单抗)、利妥昔单抗(CD20单抗)、大剂量激素以及环磷酰胺等。阿伦单抗可以通过补体介导的细胞溶解作用、抗体依赖的细胞毒作用以及凋亡机制发挥作用，已证实对氟达拉滨耐药的患者和有不良预后指标( 11q-, 17p13-)的患者治疗有效[15,16]。CD20单抗是治疗B 淋巴细胞增殖性疾病的分子靶点药物，可以通过补体依赖细胞介导的细胞毒作用(CDC)、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC )及诱导凋亡清除恶性B淋巴细胞[17]。CD20单抗联合喷司他丁和环磷酰胺在ATM缺失的CLL病例中有较好的治疗效果。近年有报道大剂量甲基泼尼松龙(HDMP)单用或联合其他细胞毒药物对难治性CLL 患者包括p53基因缺失患者有效。Castro等[18]报道，14例对氟达拉滨耐药的CLL 患者经3个疗程利妥昔单抗联合HDM P治疗后， 总有效率93%，完全缓解率36%，中位进展时间15个月，中位至下次治疗时间22个月。2008年NCCN指南指出，针对17p-的患者，如联合化疗无效，年龄小于70岁，经高剂量的化疗后，予以回输异基因造血干细胞解救。

　　4 展望

　　CLL遗传学异常具有复杂性和异质性，通过检测其遗传学异常可以对CLL进行预后评估，对临床治疗具有的重要指导意义。目前实验室检测的手段主要是CBA和FISH技术，两种检测手段各有优缺点，CBA可以提供更多的信息，但CBA要求受检细胞体外分裂，检出率、特异性均不如FISH高。细胞遗传学异常的检测在CLL的个体化治疗中将发挥越来越重要的作用。

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