多发性骨髓瘤患者外周血树突状细胞分离、培养及鉴定

　　作者：刘振华 ，郭坤元 ，赵蓉 　　作者单位: 福建医科大学省立临床学院血液化疗科，福州 350001 南方医科大学珠江医院血液科，广州 510515 福建医科大学分子医学中心，福州 350004

　　【关键词】 多发性骨髓瘤;树突状细胞;肿瘤细胞,培养的

　　摘要: 目的 研究多发性骨髓瘤(MM)患者外周血树突状细胞(DC)的分离、培养和鉴定。 方法 用塑料贴壁的外周血单个核细胞(PBMNC)来源或者免疫磁珠阴性选择分离途径，建立体外培养技术，从MM患者外周血中获取DC。 结果 (1)在含粒-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素-4的无血清培养基(AIM-V)中，37℃、体积分数为0.05的CO 2 培养箱中培养5～7d，可获得具有典型DC形态学特征的细胞。2种分离途径得率比较无统计学意义(n=5，P>0.05)。(2)同种混合淋巴细胞反应及自体抗原呈递试验证实，MM患者外周血来源DC具有很强的刺激同种异体淋巴细胞增殖能力及呈递自体抗原的能力。外周血来源DC培养5～7d后流式细胞仪分析表明，部分细胞表达成熟DC特征性标记CD1a，部分表达共刺激分子CD80及CD86，高表达HLA-DR分子，几乎不表达单核细胞特异性标记CD14。重组人白细胞介素-3或/及重组人干细胞因子加入培养体系并不增加MM患者外周血DC得率。免疫表型也无明显改变。提示DC来源于PBMNC中单核细胞，而非CD34 + 造血祖细胞。 结论 贴壁分离法及免疫磁珠法均可获取充足数量的DC。

　　关键词: 多发性骨髓瘤;树突状细胞;肿瘤细胞，培养的

　　多发性骨髓瘤(MM)因其病程相对迁延呈进展性，且每例患者均有独特肿瘤标志或肿瘤相关抗原(独特型Ig)，因此是最适的免疫治疗模型，特别是以树突状细胞(DC)为基础的免疫治疗。近年来，国外已开展以DC免疫治疗MM的临床研究。Hart等研究显示，在MM患者负载自体独特型抗原(Id)组分的单核细胞来源DC(MDDC)可刺激机体产生T淋巴细胞增殖反应和相应抗Id抗体生成 [1] 。可以相信，以DC疫苗结合转输Id特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)的过继免疫治疗途径，配合传统化疗及造血干细胞移植，有望提高MM患者治疗效果。鉴于此，笔者以贴壁分离法及免疫磁珠法从患者外周血中分离、培养及鉴定DC，检测其功能特征，为构建CTL诱导体系打下基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 对象 5例MM患者及2名健康志愿者为2004年1～8月本院住院患者。MM诊断符合文献[2]诊断标准。

　　1.2 DC分离培养 参见文献[3]。调整外周血单个核细胞(PBMNC)浓度约(3～4)×10 6 mL -1 ，取5mL加入T-25塑料培养瓶。37℃、体积分数为0.05的CO 2 孵箱中培养。2h后，以37℃的无血清培养液AIM-V轻洗培养瓶去除非贴壁的PBMNC，获贴壁的单核细胞，再加入含细胞因子的AIM-V无血清培养液4mL中继续培养:重组人白细胞介素-4(rhIL-4)10ng/mL，重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)1000IU/mL。视细胞生长情况2～3d换液1次(半量)。

　　1.3 T细胞纯化 取健康志愿者外周血，以免疫磁珠阴性选择分离系统(Stem Cell公司)分离外周血PBMNC。装置磁力架，以含4%胎牛血清(FBS)及l mmol/L EDTA的PBS洗柱;细胞上柱前加入抗体Cocktail100μL/mL，抗体为抗CD19、CD20、CD56、CD21抗体组合。冰浴15min;加入磁珠胶，60μL/mL，冰浴15min。按说明装柱。然后以含4%FBS及l mmol/L的EDTA的PBS洗柱。收集洗脱液，离心富集PBS重悬细胞，流式细胞仪测定CD3 + >97%，锥虫蓝染色细胞活率>95%，计数备用。

　　1.4 DC免疫磁珠分离 采用StemSep TM 人细胞阴性选择系统(Stem Cell公司)从外周血分离DC。抗体Cocktail为抗CD3、CD14、CD16、CD19、CD34、CD56、CD66b组合抗体，具体参见文献[4]。这些经阴性选择的细胞表面无结合抗体，以不含FBS和EDTA的PBS洗涤后，加入含rhIL-4和rhGM-CSF(浓度同1.2)的AIM-V无血清培养基中，37℃、体积分数为0.05的CO 2 培养箱中培养5～7d。

　　1.5 DC超微结构分析 DC悬液离心后，沉淀的细胞用3%戊二醛-1.5%多聚甲醛固定，经PBS漂洗后用1%锇酸固定，梯度乙醇、丙酮脱水，超薄切片，铅铀染色后，经HU-12A(日本HiTachi公司)透射电镜观察、摄片。

　　1.6 细胞表型分析 直接免疫荧光标记法。收集上述2种方法制备的DC，用PBS洗涤并重悬浮后，将PE或FITC标记的鼠抗人CD1a、CD14、HLA-DR、CD80、D86加入DC的PBS悬液，4℃暗处孵育30min，以PBS洗涤后在流式细胞仪(Epics XL-Ⅱ型，美国Coulter公司)上检测，同时以小鼠IgG-FITC或IgG-PE作阴性对照。

　　1.7 同种异体混合淋巴细胞反应(MLR) 以贴壁分离方法，从患者外周血PBMNC中，分别收集悬浮细胞及紧密贴壁细胞(巨噬细胞)作为刺激细胞，用培养液调整细胞浓度为2×10 6 mL -1 ，加入25μg/mL丝裂霉素(日本协和发酵工业株式会社)。37℃水浴30min，Hank's液洗涤3次，用含10%FBS的RPMI1640液悬浮，分别以每孔3×10 3 ，1×10 4 及3×10 4 加入96孔圆底培养板，每组设3个复孔。取新鲜分离的、健康志愿者外周血T细胞作反应细胞(磁珠分离法)，用培养液调整细胞浓度为2×10 6 mL -1 ，每孔加100μL，终体积200μL，37℃、体积分数0.05的CO 2 培养72h后，每孔加MTT20μL，继续培养5h后，加入20%SDS80μL裂解1h，以酶标仪(MAel450，BIO-RAD)读取波长为570nm处的光密度(D 570nm )值。

　　1.8 IL-3和重组人干细胞因子(rhSCF)对DC培养的影响 继免疫磁珠法分离获得DC后，设计以下4组培养条件。第1组:rhIL-410ng/mL，rhGM-CSF1000IU/mL;第2组:rhIL-410ng/mL，rhGM-CSF1000IU/mL及rhIL-350ng/mL(日本麒麟公司惠赠);第3组:rhIL-410ng/mL，rhGM-CSF1000IU/mL及rhSCF50ng/mL(日本麒麟公司惠赠);第4组:rhIL-410ng/mL，rhGM-CSF1000IU/mL，rhIL-350ng/mL及rhSCF50ng/mL，培养7d分别计数，并检测细胞免疫表型变化。

　　1.9 DC抗原递呈能力 以丝裂霉素25μg/mL灭活的DC作为抗原递呈细胞，按每孔5×10 6 个DC加入96孔圆底培养板;磁珠分离法分离患者外周血 T细胞(来源于DC同一个体)作为应答细胞，按每孔10 5 个细胞加入培养板。分3组:第1组不加抗原;第2组加入自体抗原，10μg/mL;第3组加入相应浓度的对照Ig组分(华美生物工程公司)。自体抗原的提取如下:针对患者特异Ig的相对分子质量及等电点，分别以沉淀法，层析技术从患者血清中提纯分离。IgG以离子交换层析法，继之以亲和层析。总体积每孔200μL，培养3d，MTT法测定各组细胞增殖。

　　1.10 统计学处理 数据以x±s表示。组间均数检验以t检验，率的检验以χ 2 检验。

　　2 结果

　　2.1 MM患者外周血DC的培养 从外周血PBMNC中获取的贴壁细胞或者磁珠法分离所得细胞，加入rhGM-CSF及rhIL-4培养24h后，即可见贴壁细胞形成均匀散布的细胞聚体，并有少量细胞悬浮，相差显微镜下已见伸展的突起。培养3～4d后，DC明显增多，并聚集成大小不一的细胞团，培养6～7d，细胞分散，体积变大，突起多而密，呈现典型的DC形态。不同个体的DC扩增能力有一定差异，如果每周换液2次，DC活率及表型可维持5周左右，但数量无增加。

　　2.2 DC的超微结构 细胞表面有许多不规则突起(小伪足)，细胞质中线粒体丰富，少量溶酶体及内质网，细胞周围见相邻淋巴细胞与之接触，未见Birberk颗粒(图1)。

　　图1 树突状细胞的超微结构(×4800)(略)

　　2.3 贴壁分离法及免疫磁珠法制备途径的DC得率及免疫表型见表1及图2。

　　表1 贴壁分离法及免疫磁珠法途径分离DC得率及免疫表型(略)

　　细胞数和免疫表型指标为取2例的均值. DC:树突状细胞;PBMNC:外周血单个核细胞.

　　图2 树突状细胞流式参数图(略)

　　DC培养7d，FCM分析显示部分表达DC特异性标志CD1a，而几乎不表达单核细胞特异性标志CD14，高表达HLA-DR及部分表达共刺激分子CD80及CD86。

　　2.4 同种异体混合淋巴细胞反应(图3) MM患者外周血中制备的DC较巨噬细胞(Mφ)具有更强的激发MLR的能力，表明DC有较强的抗原递呈及免疫刺激的活性。

　　2例患者均值. DC:树突状细胞;Mφ:巨噬细胞

　　图3 DC及Mφ激发同种混合淋巴细胞反应的能力(略)

　　2.5 rhIL-3和rhSCF对DC得率及免疫表型的影响 在培养体系中加入2种因子不能增加DC得率，免疫表型也无明显变化(表2)。

　　2.6 DC抗原递呈能力 T细胞在DC和自体独特型Ig存在下，可以出现显著增殖，与其他2组相比较，P<0.01，而仅有DC时不能增殖;抗原非特异时(对照Ig)，T细胞也无明显增殖(图4)。

　　表2 rhIL-3和rhSCF对DC培养得率及免疫表型影响(略)

　　细胞数为5例的均值;免疫表型为2例的均值. rhIL-3:重组人白细胞介素-3;rhSCF:重组人干细胞因子;PBMNC:外周血单个核细胞.

　　DC:树突状细胞

　　图4 DC的抗原递呈能力(略)

　　3 讨论

　　3.1 所获DC的成熟状态及细胞来源 笔者从贴壁MM患者的PBMNC中以2种途径分离获得DC。在相差显微镜和电子显微镜下有典型DC特征。部分表达成熟DC特异性标记CD1a，高表达MHCⅡ类分子HLA-DR及部分表达共刺激分子CD80，CD86;少量细胞可刺激同种异体T淋巴细胞反应增殖，并且具有特异递呈自体可溶性抗原(独特型Ig)的能力。以上均符合不成熟DC特征 [5] 。不成熟DC在外周血中可捕获和处理抗原，以胞饮作用方式来内在化可溶性抗原，并且通过αVβ5、αVβ3及CD36黏附分子结合和内在化凋亡细胞。与国外类似研究相比较，笔者培养DC得率与之相近 [6-7] 。按治疗用DC细胞数5×10 6 的要求 [1] ，采集外周血200～400mL即可满足临床需要。尽管在培养体系中加入rhSCF或/和rhIL-3，收获细胞得率及其免疫表型均无明显变化，说明这些细胞来源于PBM-NC中的单核细胞，而不是CD34 + 细胞，因为CD34 + 细胞作为DC祖细胞，在相应细胞因子培养后为树突状朗罕细胞，电镜下可见典型的Birbeck颗粒。

　　3.2 单核来源的DC(MDDC)免疫治疗价值 笔者的研究所获CD1a + 表达率较低，可能与DC不成熟相关，也可能与无血清培养体系相关 [8] 。实验证实，TNF-α虽可促使DC分化成熟，但其显著下调DC胞吞能力及可溶性抗原摄取能力 [9] 。Romani等一项实验也表明，不成熟DC在TNFα或CD40配基刺激成熟后，就丧失了内在化可溶性抗原和凋亡细胞的能力;成熟DC虽然捕获和加工抗原能力几乎丧失，但却具有很强的T细胞激活能力 [10] 。在负载肿瘤抗原研究时，对于培养DC，肿瘤坏死因子-α是不必需添加的细胞因子。自CD14 + 单核来源的DC分化成熟后，抗原递呈能力下降。利用分离的CD14 + 细胞或塑料粘附的外周血单核细胞在GM-CSF和IL-4条件下培养，获取DC纯度是较高的。该类DC最适宜于内在化、加工和处理抗原(如可溶性抗原、RNA和凋亡细胞等)，尽管仍属异质性细胞群体，但临床Ⅱ期试验表明，单核来源的DC(MD-DC)具有良好的免疫治疗效能 [11] 。陈君敏等研究表明，利用慢性粒细胞白血病患者外周血来源的自体DC，体外呈现满意的骨髓净化效果 [4] ，提示DC治疗对于残存白血病状态具有免疫治疗潜能。目前，大多数临床治疗实验采用MDDC。有研究应用外周血来源的DC负载自体Id组分主动免疫治疗MM，部分患者取得满意疗效 [12] 。外周血来源的DC有较确定的分化状态及亚群构成，容易进行表型分选;经短暂体外培养后，即可吸收摄取并递呈抗原;同时保留了对生理刺激的反应能力。这些DC如暴露于CD40配基后可发展为最合适的刺激表型。

　　3.3 建立无血清培养体系的意义 人类DC应用于免疫治疗的两个主要要求是避免来自于含小牛血清(FCS)培养基的异基因抗原和在体外高百分比DC的产生。必须强调，用于免疫治疗的DC应尽可能避免接触外植抗原或者同种抗原。特别是如胎牛血清(FBS)中的外植抗原，因为此类抗原可能占免疫优势。最近欧洲因“疯牛病”恐慌使牛血清制品受到严格限制。研究证实，血浆中存在某些蛋白质可以改变MHC-I限制性肽的免疫原性，其它所含蛋白质(如抗体)干扰DC对抗原的捕捉。因此，近来大量临床研究使用1%～10%的自体血浆、自体血清及混合人AB血清等，但更多研究倾向于使用无血清培养液，从CD34 + 或外周血中获取DC进行临床免疫治疗。事实上，资料揭示以无血清培养液获取DC，无论在表型、功能方面均与有血清培养体系无显著差异，目前无血清培养介质有AIM-V，X-VI-VO15及X-VIVO20等等。总之，合理选择培养条件，特别是适宜的因子组合对DC纯化、成熟及功能均有影响，在肿瘤免疫治疗时都应充分考虑。

　　笔者认为，笔者工作建立了从MM患者外周血 中分离培养DC的简便可行的方法，为今后获取DC进行临床免疫治疗及深入研究奠定了基础。

　　(鸣谢:DC免疫磁珠纯化部分得到福建医科大学附属第一医院陈君敏教授的指导，特此致谢。)

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