两种肾炎湿热证血尿模型的比较

作者：刘晓鹰， 王文广， 杜恒    作者单位：湖北省教育厅重点项目(20062071) 430061 武汉，湖北省中医院儿科（刘晓鹰，王文广）；430022 武汉，武汉市中西医结合医院儿科（杜恒）

【摘要】  目的 探讨价格低廉、中医证型突出的肾炎血尿模型的建立方法。方法 将Wistar大鼠在口服并定时尾静脉注射牛血清白蛋白的基础上，分别施以葡萄菌肠毒素B或高糖高脂等湿热因素造模，利用生物学方法、光学显微镜等手段对两种造模方法进行对比观察。结果 两种造模方法均成功制成血尿明显、病理改变典型的系膜增殖性肾炎大鼠模型，加强湿热因素能加重水肿及尿血、尿素氮等水平。结论 湿热模型组总体症状表现更符合临床中医湿热证型，是价格低廉且病理改变典型的肾炎血尿动物模型。

【关键词】  肾炎； 血尿； 模型； 湿热证； 系膜增殖性肾炎； 动物，实验

 doi:10.3969/j.issn.16743865.2009.02.006Comparison of two animal models of nephritis hematuria  LIU Xiaoying*，WANG Wenguang，DU Heng，*Hubei Hospital of TCM,Wuhan 430061,China

    【Abstract】  Objective  To explore the establishment of successful nephritis hematuria rat model at low prices.Methods  Based on intragastric administration and regular tail vein injection of bovine serum albumin (BSA),hematuria in nephritis was produced by a tail intravenous injection of enterotoxin B (SEB) or dampheat factors in rats respectively.Then,biological methods and light microscope were employed for comparative observations on the two ways of inducing nephritis hematuria.Results  Both of the two methods succeeded in duplicating mesangial proliferative glomerulonephritis (MsPGN) with obvious hematuria and typical pathological changes in rats.An enhanced dampheat factor could raise rat weight,aggravating edema and hematuria,as well as elevating the levels of blood urea nitrogen.Conclusion  The dampheat group shows less effectiveness in the extent of hematuria and proteinuria than the control group with SEB injection；however，it’s more accord with the “Dampheat Syndromes” in clinical TCM,thus proved to be an economical animal model of nephritis hematuria with typical pathological changes.

    【Key words】  Nephritis;  Hematuria;  Model;  Dampheat syndrome;  MsPGN；  Animal，experiment

    血尿为儿科各类肾脏病中最常见的症状，国内儿童发生率较高，近年研究提示，孤立性血尿并非良性过程，随着慢性肾脏病概念的提出，人们对其严重性更为关注，但目前尚无有效的治疗方法［1］。

    笔者在前期临床研究中发现，小儿血尿多表现为湿热证，予清热利湿之中药复方“金水清”能明显减轻血尿症状［2］。为进一步探求中药治疗本病的作用机制，研制符合中医医理的肾炎血尿模型尤为重要。现就两种血尿模型的比较结果报道如下。

    1  材料与方法

    1.1  材料  （1）6周龄SPF级雄性Wistar大鼠40只,体质量（150±20）g,购自湖北省实验动物中心；高糖高脂饲料由湖北省中医院制剂科生产。（2）牛血清白蛋白(BSA)，ROCHE购买；葡萄球菌肠毒素B(SEB)，军事科学院微生物研究所提供。（3）SHH500GS人工气候箱（重庆市永生实验仪器厂）；YCD205超声波加湿器（北京亚都科技股份有限公司）。

    1.2  方法  40只大鼠经适应性饲养1周后，查尿红细胞、蛋白全部为阴性，随机分为4组，每组10只。

    1.2.1  对照模型组参照胡海翔等［3］的方法。隔日灌胃含0.1% BSA的酸化水2 mL，第6周时定期尾静脉注射1% BSA缓冲液10 mg/(kg·d)，连续3次，8周时尾静脉注射SEB 0.4 mg/（kg·d)，连续3周。观察至第12周末。

    1.2.2  湿热模型Ⅰ组  造模方法与对照模型组相似，但第4周时，参照吴仕九等［4］报道，增加饮食和环境因素。将大鼠置于恒温恒湿箱中（温度35 ℃，相对湿度95%），温度和湿度逐步提升，每日不超过5 ℃，120 h后移至自然环境。入箱前10 d和入箱期间，都以高糖高脂饲料喂养。第8周不用SEB，而是注射等量生理盐水。观察至第12周末。

    1.2.3  湿热模型Ⅱ组  造模方法与湿热模型Ⅰ组相同，但在第5周，再次增加饮食和环境因素，置于造模箱中共240 h。

    1.2.4  正常组  隔日口服酸化水2 mL，定期尾静脉注射生理盐水，至第12周末。

    1.3  指标的观察及检测  定时观察、记录大鼠体温（肛温）、活动状态、食量、饮水、体质量、粪便、毛发等一般情况；用代谢笼每周末留尿检测各组大鼠12 h尿红细胞数，并于0，12周末留尿测24 h尿蛋白定量。

    至12周末，禁食12 h后，麻醉处死，无菌摘除眼球取血，测血清总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素氮和肌酐；迅速打开腹腔取出肾组织，做光镜检测。

    1.4  统计学分析  采用SPSS 13.0统计学软件进行统计学分析，各组实验数据以±s表示,统计分析用单因素方差分析和t检验，检验差异有统计学意义设为P<0.05。

    2  结果

    2.1  一般情况  与正常组相比，造模动物均出现程度不等发热、嗜卧、行动呆滞、耸毛、饮水少、食欲不振、肛门红肿、大便烂、尿少色深、舌质暗红，部分大鼠出现眼眵、舌苔稍白腻、腹泻、皮下水肿等表现。3～5 d后，各组上述表现基本恢复，但湿热模型Ⅱ组皮下水肿、尿少色深等情况持续到实验结束。且湿热模型大鼠体质量、入箱前24 h与出箱后24 h体温净增值较正常组、对照模型组显著增加,见表1；提示增加环境与饮食湿热因素后，能出现更明显的发热、水肿等表现。

    2.2  尿素氮、血肌酐水平测定  12周末，与正常组比较，造模动物尿素氮、肌酐水平均有增高，对照模型组与湿热模型组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

    2.3  尿红细胞及尿蛋白测定  与正常组相比，造模动物尿红细胞数、尿蛋白明显增多，且持续至实验结束。第9周，湿热模型Ⅱ组尿红细胞数开始显著多于湿热模型Ⅰ组，说明增加环境与饮食湿热因素能加重血尿；湿热模型组尿红细胞、蛋白定量在统计学上不及对照模型组。见表1，2。表1  各组实验大鼠入箱前24 h与出箱后24 h体温净增值12周末体质量、24 h尿蛋白、肾功能比较注：与正常组比较，aP<0.01;与对照模型组比较，bP<0.05，cP<0.01。 表2  各组实验大鼠尿红细胞比较注：与正常组比较，aP<0.01，与对照模型组比较，bP<0.05;cP<0.01；与湿热模型Ⅰ组比较，dP<0.05,eP<0.01。

    2.4  血脂水平测定  12周末，与正常组比较，造模动物总胆固醇、三酰甘油水平明显增高，对照模型组与湿热模型组之间差异不明显;湿热模型Ⅱ组三酰甘油显著高于湿热模型Ⅰ组。（数据资料略）

    2.5  光镜组织学检查  光镜下，造模大鼠均可见弥漫性肾小球系膜区增宽，系膜细胞、系膜基质增生，毛细血管腔狭窄，部分肾小球呈分叶状，个别肾小球萎缩，肾小囊轻度扩张，肾小管间质有炎细胞浸润。湿热模型Ⅰ组、湿热模型Ⅱ组病理改变相似，但没有对照模型组严重。

    3  讨论

    近年来，在中医药研究领域，以中医理论为基础建立相关动物模型已成为共识［5］。要求从临床角度、从证入手复制“病证结合”的动物模型，使动物模型不仅符合西医各种疾病的病理特征，具备与临床疾病相似的病理演变过程和发展规律，而且有中医临床相关病证的特点，以保留中医精华，不失中医本色。笔者从众多资料中发现［3，6，7］，胡海翔等［3］研究的模型大鼠早期有嗜卧、耸毛、饮水少、食欲不振、大便烂等中医湿热表现，但呈一过性便自行恢复；造模中晚期，有持续血尿、蛋白尿，血清胆固醇、三酰甘油、血肌酐、尿素氮等指标升高，结合近年肾炎湿热证与上述指标密切相关的临床报道［8，9］，可以认为，本模型近似中医肾炎湿热证，但不典型,且SEB价格昂贵（约占总造模成本的90%），多需从国外进口，不利于该模型的推广。中医认为：湿热的产生，不外外感与内生，以此为基础，笔者对胡海翔模型加以改良，不用SEB，而是通过饮食油腻、注入BSA损伤脾胃造成内湿，气候因素制造外湿，将产生湿热证的内因及外因有机的结合，其发病条件符合临床中医湿热证的产生机制，使模型更能反映中医肾炎湿热证的本质与全貌。

    实验结果显示，两种造模方法都呈现出典型的病理特征和持续稳定的血尿、蛋白尿。湿热模型组的尿红细胞数、蛋白定量，虽然在统计学上不及对照模型组，但并不影响血尿模型的成功建立，且在临床特征上更能具备中医湿热证的特点，以湿热模型Ⅱ组最为明显。湿热模型组在体温、体质量、水肿表现上较对照模型组严重，持续时间更长，与中医湿热内蕴的临床表现相符；增加湿热因素后，湿热模型Ⅱ组在血尿、浮肿、体质量、三酰甘油等指标上均明显高于湿热模型Ⅰ组，尿蛋白、尿素氮、肌酐也有所加重，说明加强湿热因素能加重大鼠的病变程度。由于湿热既是本病的致病因素，也是病理产物，其滞留于肾，热伤肾络可加重血尿，湿浊下注而为蛋白尿，久则耗血伤阴，终致肾气匮乏，肾阳耗损，肾虚无力主水、司开合，而见水肿、尿少等症。由此可推，如果对湿热模型组再增加湿热因素，是否能得出与对照模型组同样的，甚至更好的实验结果，此推论符合临床实际及中医医理，但需进一步实验的验证。

    总之，认为不用SEB，仅增加湿热因素就能制成既有MsPGN病理特征，又符合中医湿热病机、证型的肾炎血尿模型，且价格低廉。至于湿热因素给予量的把握问题，尚需进一步探讨，使该模型更符合中医动物实验研究的需要。

【参考文献】［1］ Hui Kim Yap，徐虹.对慢性肾脏病概念的再认识［J］.中国循证儿科杂志,2007,2(4):241244.

［2］ 张雪荣,李云海.刘晓鹰教授治疗小儿单纯性血尿经验［J］.中医药通报,2005,4(2):5355.

［3］ 胡海翔,贾海骅.滋肾止血片对实验性IgA肾病大鼠治疗作用的实验研究［J］.中国中医基础医学杂志,1999,5(1):3944.

［4］ 吴仕九,杨运高,杨钦河,等.温病湿热证动物模型的研制及清祛湿法机理的探讨［J］.中国中医药科技,1999,6(2):6567.

［5］ 赵慧辉，王伟.病证结合证候模型研究基本思路［J］.中华中医药杂志,2006,21（12）：762764.

［6］ 徐巍,张玉梅,吴茜，等.肾炎Ⅱ号治疗IgA肾病血尿的实验研究［J］.中国中医药科技,2002，9(1):2627.

［7］ 周家俊，高建东，何立群，等.固本通络冲剂治疗IgA肾病的实验研究［J］.中国中西医结合肾病杂志，2003，4（8):442444.

［8］ 沈庆法.肾脏病湿热证的研究［J］.浙江中医学院学报,2000,24(1):3942.

［9］ 刘宏伟.原发性肾小球疾病湿热病理的临床研究［J］.中医杂志,1996，37(11):688.