三氧化二砷对多发性骨髓瘤骨髓基质细胞增殖及分泌细胞因子的影响

　　作者：谭竞，刘霆，朱焕玲，孟文彤，余江 作者单位：四川大学华西医院血液科，成都 610041

　　【摘要】 为了探讨三氧化二砷(As2O3)对多发性骨髓瘤(MM)患者骨髓基质细胞(BMSC)增殖及其分泌白细胞介素-6(IL-6)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)能力的影响，用体外培养MM患者骨髓的方法获得BMSC。BMSC和MM细胞株CZ-1单独或共同培养，给予不同浓度As2O3(1-20.0 μmol/L)处理，用MTT法检测细胞活性，用ELISA法检测IL-6、VEGF的分泌水平。 结果表明： As2O3对CZ-1细胞有生长抑制作用，48小时后细胞生长抑制50 %的浓度(IC50)为2.3 μmol/L，但对BMSC的生长无影响; MM患者BMSC高分泌IL-6、VEGF，经As2O3作用后BMSC分泌IL-6、VEGF降低，骨髓瘤细胞和BMSC相互作用导致的过量IL-6、VEGF分泌也可被As2O3抑制，其抑制程度与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。 结论： As2O3不能抑制BMSC的生长，但可以抑制其分泌IL-6及VEGF。

　　【关键词】 多发性骨髓瘤

　　Effect of Arsenic Trioxide on Bone Marrow Stromal Cells of

　　Patients with Multiple Myeloma

　　TAN Jing，LIU Ting，ZHU Huan-Ling，MENG Wen-Tong，YU Jiang

　　Department of Hematology，West China Hospital，Sichuan University，Chengdu 610041，China

　　Abstract To explore the effect of arsenic trioxide(As2O3)on growth and secretion of interleukin-6(IL-6)and vascular endothelial growth factor(VEGF)of bone marrow stroma cells (BMSC) from the patients with multiple myeloma (MM). Specimens of bone marrow aspiration from MM patients were used to establish BMSC cultures.BMSC and human MM cell line CZ-1 were cultured together or alone in the absence or presence of As2O3 at various concentrations(1-20.0 μmol/L).Cell growth inhibition was assessed by MTT assay，cytokines in the culture supernatants were measured with ELISA.The results showed that As2O3 had cytostatic effect on CZ-1 with fifty percent growth inhibition (IC50)for 48 hours at 2.3 μmol/L.As2O3 did not inhibit the growth of BMSC.High levels of IL-6 and VEGF have been found in the culture supernatants of BMSC from MM patients.Cytokine production of BMSC treated with As2O3 significantly decreased as compared with controls(P<0.05).Excitingly，even the increased cytokine production triggered by adhesion of MM cell and BMSC was also inhibited by As2O3.It is concluded that As2O3 has no inhibitory effect on cell growth of BMSC，but inhibit the production of IL-6 and VEGF by BMSC.

　　Key word multiple myeloma; arsenic trioxide; bone marrow stromal cell; cytokine

　　多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)目前仍不能被治愈，骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSC)在MM的发病机制中起着重要作用，自分泌和旁分泌的细胞因子白细胞介素-6(IL-6)、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可促进瘤细胞生长和参与耐药。新近的研究表明，以骨髓瘤细胞和BMSC为靶向治疗的药物如沙利度胺、蛋白酶体抑制剂等治疗骨髓瘤取得了较好的效果，已有研究证实了As2O3对骨髓瘤细胞有作用。本研究探讨As2O3对BMSC的生长及分泌IL-6、VEGF的影响，报道如下。

　　材料和方法

　　试剂

　　As2O3(哈尔滨伊达药业公司产品)用PBS配制成200 μmol/L的储存液，过滤除菌，分装后置4℃保存，使用前用RPMI 1640培养液稀释。

　　骨髓基质细胞分离培养

　　参考杨吉成等BMSC培养方法[1]并作了修改，于髂后上棘取MM患者骨髓5 ml，肝素抗凝，Ficoll-Hypaque梯度法分离单个核细胞。培养液洗涤2次，用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，于37℃、5 % CO2、饱和湿度条件下静置培养。每3-4天半量换液。待贴壁的骨髓基质细胞形成单层后，用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代。取少量细胞加入放有灭菌盖玻片的6孔板培养，待其贴玻片生长后，取出爬片进行碱性磷酸酶(ALP)染色。光学显微镜下观察ALP阳性细胞。

　　细胞系的培养

　　人多发性骨髓瘤细胞株CZ-1(第二军医大学长征医院侯建教授馈赠)用含10 %小牛血清的RPMI 1640培养液于37℃、5 % CO2、饱和湿度条件下培养，3-4天传代1次。

　　细胞生长抑制检测

　　96孔板接种细胞3×104/孔，加入终浓度分别为1、2、5、10、20 μmol/L的As2O3，每一浓度设4个复孔。培养48小时后，每孔加入5 mg/ml的MTT(Sigma公司)液10 μl，继续孵育4小时，离心去上清，加入二甲亚砜(DMSO)50 μl/well，振荡10分钟，酶标仪(Bio-Rad 550)测定570 nm处吸光度(A)值。根据A值计算细胞活性，并计算细胞生长抑制50%的As2O3浓度，即IC50值。

　　培养上清细胞因子检测

　　将BMSC以2.5 g/L胰蛋白酶消化制成细胞悬液，种入24孔板，2×104/孔。按实验设计要求加入As2O3，使体系的体积为450 μl/well，As2O3终浓度为1、5、10 μmol/L，对照组不加As2O3。按同种方法接种CZ-1及CZ-1+BMSC细胞，CZ-1+BMSC组每孔加入CZ-1和BMSC各2×104个，加入As2O3使终浓度为1、5、10 μmol/L。细胞于37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养24小时后，取离心后的培养上清于-20℃保存、待测。用ELISA法测定IL-6、VEGF水平。在酶标仪(Bio-Rad 680)上读取每孔的吸光度(A)值。取复孔浓度的平均值。

　　统计学分析

　　用SPSS 10.0统计学软件分析数据，药物处理前后的显著性差异用Mann-Whitney U检验确定。

　　结 果

　　光学显微镜观察

　　培养所得到的BMSC中ALP阳性细胞为(75.2±4.5)%。骨髓基质细胞由细胞群体组成，主要包括成纤维细胞、内皮细胞、成骨细胞、巨噬细胞等，它们均表达碱性磷酸酶，我们所获得的细胞ALP阳性率为(75.2±4.5)%，说明所得细胞主要为骨髓基质细胞。

　　As2O3对骨髓瘤细胞株CZ-1及BMSC的生长影响

　　用MTT法检测细胞活性显示：经不同浓度As2O3作用48小时后的CZ-1，细胞生长受抑制，抑制作用随浓度增加而增强，与对照组比较有显著差异(P均<0.05)。48小时后细胞生长抑制50%的浓度(IC50)为2.3 μmol/L(图1)。以同样的方法检测As2O3对MM患者及健康人BMSC生长的影响，发现As2O3作用48小时后MM患者及健康人BMSC均未受到明显的抑制，即使在较高的浓度(20 μmol/L)下对生长的抑制<20%，与对照组细胞活性比较无显著性差异(P=0.45)。

　　As2O3对BMSC及CZ-1细胞分泌细胞因子的影响

　　MM患者及正常人BMSC均分泌IL-6、VEGF，MM患者BMSC分泌IL-6、VEGF的水平明显高于正常人。CZ-1细胞能分泌少量的VEGF，未检测出有IL-6分泌。MM患者BMSC与CZ-1细胞共培养时VEGF及IL-6分泌均增加，大于它们单独培养分泌量的总和。经As2O3处理后BMSC分泌IL-6及VEGF受抑制，抑制程度随As2O3浓度增加而增强，并且MM细胞和BMSC共培养引起增加的细胞因子分泌增加也可以被As2O3抑制(图2、图3、)。无论单独培养还是与CZ-1细胞共培养，BMSC经As2O3作用24小时后其IL-6、VEGF分泌较对照组有显著性差异(P均<0.05)(附表)。Table.Effect of As2O3 on cytokine secretion(略)

　　讨 论

　　我们的实验中，3例难治性MM患者BMSC都高分泌VEGF、IL-6，分别是正常人的3-4倍和2.8-5.9倍。IL-6参与肿瘤克隆形成和瘤细胞抗凋亡，包括对抗地塞米松的促凋亡作用，通过抑制体液免疫及活化破骨细胞引起相应的临床表现。在MM患者血清中也发现IL-6水平增高。抗IL-6单克隆抗体可以减少MM细胞增生而降低瘤细胞负荷。所以，IL-6被认为是MM发病中重要的细胞因子。VEGF能和瘤细胞表面VEGFR-1/Flt-1结合，通过促分裂活化蛋白激酶(MAPK)途径促进MM增生，通过蛋白激酶C(PKC)途径促进MM迁徙，提示VEGF参与调节瘤细胞的生长和疾病发展[2]。BMSC与CZ-1细胞共培养时VEGF分泌量明显增加，超过二者单独培养的总和，共培养情况下IL-6的分泌也较单独培养时显著地增加，证实了细胞间的相互作用对分泌细胞因子的促进作用。其机制可能是细胞间黏附及细胞传导激活了编码细胞因子的启动因子[3]。这和Dankbar等[4]提出的MM细胞分泌VEGF刺激BMSC分泌IL-6，反过来IL-6又刺激MM细胞分泌VEGF相符。MM过度分泌IL-6的来源有MM细胞自身分泌及旁分泌学说，也有MM细胞和BMSC共同分泌IL-6假设。在本实验CZ-1的培养上清中未检测出IL-6。本实验发现，健康人BMSC与CZ-1共培养其分泌IL-6的能力也有增加，这也提示MM细胞和基质细胞通过分泌细胞因子及细胞接触触发信号传导，使细胞因子的转录和分泌增加。

　　近年来出现的以MM细胞及骨髓基质细胞为靶点的新药物，如沙利度胺及其衍生物和蛋白酶体抑制剂等，治疗复发和难治性MM取得了较好的效果，促进了针对MM及基质细胞的治疗研究。已有研究证实，As2O3能抑制MM细胞生长，促其凋亡，包括对阿霉素及马法兰耐药的细胞株[5]。本研究显示，在临床可达到浓度的条件下，As2O3能抑制CZ-1细胞的生长，50%生长抑制浓度(IC50)为2.3 μmol/L，证实了临床血药浓度的As2O3对骨髓瘤细胞的生长抑制作用。在实验中也发现As2O3对健康人及MM患者的BMSC均未表现出生长抑制作用，即使在较高的浓度(20.0 μmol/L)下作用48小时，细胞活性与对照组相比依然大于80%，这说明BMSC对As2O3不敏感。

　　我们对As2O3处理后细胞分泌的细胞因子做了检测。发现无论单独或共同培养，As2O3均可抑制BMSC过度分泌的细胞因子，提示As2O3可以打破BMSC和MM之间的旁分泌环，抑制细胞间相互作用导致的IL-6、VEGF过度分泌。在本实验中发现，As2O3对BMSC生长无明显抑制作用，但明显影响其细胞因子的分泌，无论单独培养还是和MM细胞共培养，As2O3对BMSC的作用不是直接破坏细胞，而是对其功能的调控。有研究发现，VEGF可以介导MM细胞迁徙和BM血管新生[2]，提示As2O3可能通过减少VEGF的分泌而阻断该过程。IL-6和VEGF通过阻滞单个核细胞分化为DC及抑制DC成熟而抑制DC的抗原呈递功能，因而As2O3可能通过克服对DC的这些影响而改善MM患者的免疫受抑。As2O3通过上调细胞表面的受体/配体系统而提高LAK细胞对MM细胞的识别、黏附和破坏，提示As2O3也具有提高非特异免疫能力的作用[6]。

　　最近的一些临床实验显示，As2O3治疗传统化疗耐药的患者取得了一定的疗效[7]。根据目前的研究治疗显示，As2O3治疗多发性骨髓瘤显示有促进瘤细胞凋亡、抑制瘤细胞周期、抑制细胞因子分泌、降低瘤细胞和骨髓基质细胞的黏附、增强抗瘤免疫等作用。As2O3是一种有前途的治疗多发性骨髓瘤的药物，其疗效和机理值得深入研究。

　　【参考文献】

　　1杨吉成，盛伟华，李丽娥等.骨髓基质细胞的造血支持作用等生物学特性的研究.细胞与分子免疫学杂志，2001;17：41-45

　　2Podar K，Tai YT，Davies FE，et al.Vascular endothelial growth factor triggered signaling cascades mediating multiple myeloma cell growth and migration.Blood，2001; 98:428-435

　　3Chauhan D，Uchiyama H，Akbarali Y，et al.Multiple myeloma cell adhesion-induced interlukin-6 expression in bone marrow stomal cells involves activation of NF-κB.Blood，1996;87:1104-1112

　　4Dankbar B，Padro T，Leo R，et al.Vascular endothelial growth factor and interleukin-6 in paracrine tumor-stromal cell interactions in multiple myeloma.Blood，2000;95:2630-2636

　　5Hayashi T，Hideshima T，Akiyama M，et al.Arsenic trioxide inhibits growth of human multiple myeloma cells in the bone marrow microenvironment.Mol Cancer Ther，2002; 1:851-860

　　6Hayashi T，Hideshima T，Anderson KC.Novel therapies for multiple myeloma.Br J Haematol，2003;120:10-17

　　7Munshi NC，Tricot G，Desikan R，et al.Clinical activity of arsenic trioxide for the treatment of multiple myeloma.Leukemia，2002;16:1835-1837