EGCG对多发性骨髓瘤细胞KM3促血管新生作用的抑制效应及机制初探

　　作者：邵菁，陈智超，李秋柏，吕建 作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院血液病研究所，武汉 430022

　　【摘要】 本研究探讨绿茶茶多酚成分之一表没食子儿茶素没食子酸酯[(-)epigallocatechin3gallate，EGCG) ]对多发性骨髓瘤细胞KM3促血管新生作用的影响及其机制。 体外培养多发性骨髓瘤细胞KM3，观察不同浓度EGCG作用后的培养上清对血管内皮细胞株HUVEC迁移和形成血管能力的影响。ELISA法检测KM3细胞培养上清中血管内皮生长因子(VEGF)分泌水平;RTPCR方法检测KM3细胞VEGF mRNA表达水平。 结果表明： EGCG以浓度依赖方式抑制KM3细胞培养上清促内皮细胞迁移的作用，5, 25, 50和100 μmol/L的EGCG迁移细胞数目分别为414±27，299±70，202±42及 116±13个，且EGCG的浓度与内皮细胞的迁移数目呈负相关(r= -0.952,p<0.05)。同时，内皮细胞形成小管的面积随EGCG浓度的升高而减少， 25及50 μmol/L时的面积分别是88343.9±3231.1和60897.5±914.1 μm2，均明显低于对照组(p<0.01)，小管面积与EGCG浓度呈负相关(r= -0.888,p<0.05)。5、25、50、100 μmol/L的EGCG作用于KM3细胞48小时后培养上清中VEGF的含量分别为1399.0±47.4 pg/ml，660.1 ±5.7 pg/ml，108.5 ±5.8 pg/ml和26.2±18.6 pg/ml，与对照组比较，25、50、100 μmol/L组均有统计学意义(p<0.01)。RTPCR结果显示EGCG抑制KM3细胞VEGF的 mRNA水平表达，且呈浓度依赖性。结论： EGCG能显著抑制多发性骨髓瘤细胞KM3的促血管新生作用;下调VEGF转录水平的表达，减少VEGF的分泌可能是其药理作用机制之一。

　　【关键词】多发性骨髓瘤

　　Inhibitory Effect of EGCG on Angiogenesis Induced by Multiple Myeloma Cell line KM3 and Its Mechanism

　　SHAO Jing, CHEN ZhiChao, LI QiuBai, L Jian

　　Institute of Hematology , Union Hospital , Tongji Medical College , Huazhong University of Science and Technology , Wuhan 430022 , China

　　Abstract The aim of this study was to investigate the effect of [(-)epigallocatechin3gallate (EGCG)] on angiogenesis induced by multiple myeloma cell line KM3 and its mechanism. The effects of KM3 cell supernatant after being treated with EGCG in different concentrations on migration and vascular formatiem ability of endothelial cell line HUVEC were investigated through culture of MM cell line KM3 in vitro. The secretion level of vascular endothelial growth factor (VEGF) in KM3 cell supernatant and the expression level of VEGF mRNA in KM3 were detected by ELISA and RTPCR respectively. The results indicated that the KM3 cell supernatant significantly induced endothelial cell migration and vassel formation in vitro. EGCG inhibited the effect of endothelial cell migration induced by KM3 cell supernatant, and the numbers of migrated cells were 414±27, 299±70, 202±42 and 116±13 at 5, 25, 50, 100 μmol/L respectively. The numbers of migrated cells showed negative correlation with the dose of EGCG (r=-0.952, p<0.05). The areas of the capillarylike structures decreased while the concentrations of EGCG increased, 88343.9±3231.1 μm2 at 25 μmol/L, 60897.5±914.1 μm2 at 50 μmol/L, which were significantly less than that in the control (p<0.01)and showed negative correlation with the dose of EGCG(r=-0.888, p<0.05). 48 hours after treatment with EGCG at concentrations of 5, 25, 50 and 100 μmol/L , the levels of VEGF in the culture supernatant were 1399.0± 47.4，660.1±5.7，108.5±5.8 and 26.2±18.6 pg/ml respectively. Except 5 μmol/L, all the other groups showed significant changes while compared with the controls (p<0.01). Furthermore, EGCG depressed the mRNA expression of VEGF in KM3 cells in a dosedependent manner. It is concluded that the EGCG can significantly inhibit angiogenic ability of multiple myeloma KM3 cells, its pharmacological mechanism may be downregulation of VEGF mRNA expression and reduction of VEGF secretion.

　　血管新生(angiogenesis)是指在原有血管的基础上形成新的微小血管，在大多数的恶性肿瘤的增殖及转移中有重要作用，是肿瘤生长和转移的前提。众多研究表明，血管新生与多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)的发生、预后密切相关[1，2]。随着对血管新生在MM发病机制中重要作用逐步认识，抗血管新生治疗的靶向治疗药物也在临床应用中取得了明显疗效。本实验通过研究表没食子儿茶素没食子酸酯[(-) epigallocatechin 3gallate，EGCG)]在MM细胞促血管新生效应中的作用及其机制，寻找EGCG在MM治疗中的理论依据，以及骨髓瘤的新治疗途径。

　　主要试剂

　　RPMI 1640培养液、胎牛血清(FBS)购自Gibco公司。EGCG购自Sigma公司，以无血清RPMI 1640配成10 mmol/L储存液，使用前用无血清RPMI 1640稀释成不同的工作浓度。Transwell细胞培养板购自Corning公司，Matrigel基质胶为Becton Dickinson公司的产品。人血管内皮生长因子(VEGF)ELISA试剂盒购自深圳晶美公司。引物由上海生工生物工程公司合成，TRIzoL试剂购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒、Taq DNA 聚合酶和dNTP 为Fermentas 公司产品。

　　细胞培养

　　人多发性骨髓瘤细胞株KM3由上海长征医院侯健教授惠赠，人内皮细胞株HUVEC由本实验室常规保存。KM3和HUVEC细胞均于含10%FBS的RPMI 1640培养液，在37℃、5% CO2、 饱和湿度的培养箱中培养，HUVEC细胞由0.25%胰酶消化传代。

　　骨髓瘤细胞培养上清的获取

　　取对数生长期的KM3细胞，以含1% FBS的RPMI 1640培养液重悬细胞，调整细胞密度为1×105/ml ，分别以不同终浓度(0、5、25、50、100 μmol/L)的EGCG作用于KM3细胞。48小时后，2 000转/分离心5分钟去除细胞碎片，取上清用于实验。

　　内皮细胞迁移实验

　　参考文献[3]方法， HUVEC细胞消化后用含1% FBS的RPMI 1640培养液重悬细胞，调整细胞密度为1×106/ml，Transwell细胞培养板上室中加入100 μl HUVEC细胞悬液;下室中加入600 μl不同浓度的EGCG作用后的KM3细胞培养上清，以未经EGCG作用的上清为阳性对照，PBS为阴性对照，每组设3个复孔。细胞在培养箱中继续培养6小时后，取出Transwell小碟，无水甲醇固定5分钟，瑞氏染料染色15分钟，PBS冲洗，用棉棒擦去膜上表面的细胞，用PBS反复冲洗，晾干，切下聚碳酸酯膜，中性树脂封片。于显微镜下(×200)计数迁移到膜下表面的细胞，每张膜随机计数5个视野。

　　内皮细胞小管形成实验

　　参考文献[4]方法，于96孔板中，每孔加入60 μl Matrigel基质胶，37℃ 1小时成胶。以不同浓度的EGCG作用的KM3细胞培养上清重悬HUVEC细胞，然后种入已铺胶的96孔板中，每孔3×104个细胞，以未经EGCG作用的上清为阳性对照，PBS为阴性对照，每组设3复孔。细胞培养箱中继续培养20小时后于显微镜下(×40)观察并拍照，应用ImagePro Plus软件分析形成小管(tubule)的面积。

　　VEGF浓度的测定

　　采用人VEGF ELISA 试剂盒检测KM3细胞培养上清中VEGF浓度，操作步骤按说明书进行，样品及标准品均双复孔检测。

　　EGCG对KM3细胞VEGF mRNA 影响的RTPCR检测

　　按TRIzoL说明书提取总RNA，紫外分光光度计测定RNA纯度(A260/A280>1.8)和含量。取总RNA 2 μl，Oligo(dT) 1 μl,DEPC水补充至12 μl，70℃预热5分钟，再依次加5×buffer 4 μl，RNA酶抑制剂1 μl，10 mmol/L的dNTP 2 μl，37℃孵育5分钟，再加逆转录酶1 μl，42℃，60分钟，停止反应。VEGF的引物序列正义链5′TGCCTTGCTGCTCTACCT CC3′，反义链5′TCACCGCCTCGGCTTGTCAC3′，产物VEGF121 409 bp，VEGF165 613 bp。βactin的引物序列是正义链5′GACAGGATGCAGAAG GAGATTACT3′,反义链5′TGATCCACATCTGC TGGAAGGT3′,扩增产物141 bp。取2 μl cDNA ，加10×buffer 2.5 μl ，Taq酶1 μl，dNTP 0.5 μl，MgCl 21 μl，VEGF或βactin上下游引物各1 μl，用DEPC水补充体积至25μl。反应采用SDPCR程序[5]，94℃预变性5分钟，94℃变性1分钟，退火温度自65℃开始，以3℃幅度递减至53℃，每个温度退火2分钟，72℃延伸1分钟，4个循环，5个温度共20个循环，然后以50℃为退火温度进行12个循环，最后72℃充分延伸7分钟。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，紫外光显影。

　　统计学分析

　　实验数据以±SD表示，应用SPSS 12.0统计软件，组间分析采用两独立样本的t检验及相关分析方法进行处理。

　　结 果

　　EGCG对KM3细胞培养上清诱导的内皮细胞迁移的抑制作用

　　从阴性对照组可以看出，内皮细胞本身具有一定的迁移能力，而未经EGCG作用过的KM3细胞培养上清能明显促进内皮细胞的迁移、细胞数增加。经不同浓度EGCG作用48小时的KM3细胞培养上清对内皮细胞的迁移效应明显低于阳性对照组，迁移细胞的数目随着EGCG药物浓度的升高而减少(图1)。阳性对照组与阴性对照组，EGCG药物作用组与阳性对照组之间相比较均有统计学意义(p<0.01)(表1)。内皮细胞迁移数目与EGCG药物浓度的直线相关性分析结果显示，二者呈负相关(r=-0.952, p<0.05)。

　　EGCG对KM3细胞培养上清诱导的内皮细胞小管形成的抑制作用

　　未经EGCG作用的KM3细胞培养上清能诱导内皮细胞在Matrigel上形成小管状结构，逐渐成网状相连。与阴性对照相比，管腔完整，数目多。经不同浓度EGCG作用48小时的KM3细胞培养上清对内皮细胞的小管形成效应明显低于阳性对照组，管腔面积随着EGCG药物浓度的升高而减少，100 μmol/L EGCG作用组已无完整的管腔形成(图2)。阴性对照组与阳性对照组，25、50 μmol/LEGCG药物作用组与阳性对照组之间相比较均有统计学意义(p<0.01)(表2)，内皮细胞形成小管的面积与EGCG药物浓度之间呈负相关(r=-0.888, p<0.05)。

　　讨 论

　　表没食子儿茶素没食子酸酯[(-)epigallocatechin3gallate, EGCG)]是绿茶茶多酚的一种主要成分，具有多种生理活性和药理效应。众多的研究表明，EGCG在肿瘤的防治中有重要作用，其抑癌机制包括抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡和下调Bcl2蛋白的表达[6]。EGCG还能强烈抑制端粒酶的活性，引起肿瘤细胞端粒的缩短、染色体的改变和对与细胞寿命相关的β-半乳糖苷酶的表达的抑制[7]。另外也有研究表明,EGCG可诱导骨髓瘤细胞的凋亡，其机制与线粒体膜电位的下降，细胞色素C 、Smac/DIABLO和AIF从线粒体的释放及升高胞内活性氧水平相关[8]。由此证实，EGCG对MM也有较强的抗肿瘤作用。

　　EGCG除上述的抗肿瘤效应外，还有研究表明在乳腺癌等肿瘤中具有抗血管新生的作用[9，10]。血管新生在MM的发病中有重要意义，并和预后密切相关，以抗血管新生为靶点的治疗已成功的应用于临床[11]。EGCG是否可抑制MM的促血管新生作用目前尚无报道。本实验采用内皮细胞迁移和小管形成实验证明，MM细胞的培养上清具有明显的促内皮细胞迁移和小管形成的作用，而经不同浓度的EGCG作用后的MM细胞上清诱导内皮细胞迁移和小管形成的能力是逐渐减弱的，且呈浓度依赖性，说明在体外实验中EGCG可明显抑制MM细胞诱导的血管新生作用。

　　肿瘤的血管新生有赖于肿瘤细胞分泌的血管新生因子与内皮细胞的相互作用。VEGF作为血管新生中重要的正调控因子已发现在MM细胞系及来源于患者的瘤细胞中高表达[12]，其mRNA通过不同的剪切方式产生了5种不同的异构体，其中VEGF165在体内最常见，除可存在于细胞表面或细胞外基质中，还可分泌至细胞的培养上清中。在体内，VEGF通过存在于内皮细胞上的VEGF受体特异性作用于血管内皮细胞的有丝分裂，刺激血管内皮细胞增殖和迁移.促进新生血管生长[13]。本实验通过ELISA方法检测MM细胞培养上清中VEGF的含量显示，经25 μmol/L的EGCG作用48小时后上清中的VEGF浓度即有明显下降，且与EGCG呈浓度依赖性。从mRNA水平的检测可以看到，EGCG对VEGF在转录水平的作用与蛋白分泌水平结果一致，即在转录水平抑制了VEGF的表达，从而减少蛋白的分泌，明确了EGCG抑制MM细胞的促血管新生作用可能是以抑制促进血管新生因子VEGF表达为机制，从而阻断其与内皮细胞上特异受体的结合，激活下游的信号传导及相应的生物学效应。

　　本研究初步探讨了EGCG抑制MM血管新生作用及其机制，但其上游调控机制和是否存在其他机制尚不清楚，这些均有待进一步的研究。绿茶是国人所喜爱的传统保健饮料之一，EGCG作为绿茶茶多酚的一种，来源广泛。深入研究其对MM的抗肿瘤机制和药理效应，对开发新的抗MM药物有重要意义。

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