应用蛋白质组学技术研究HL60细胞及其耐阿霉素细胞株的蛋白表达差异

　　作者：胡建达， 林敏辉， 陈鑫基， 刘庭波， 魏天南， 李 静， 吕联煌　 作者单位：福建医科大学 附属协和医院、福建省血液病研究所，福州 350001

　　【摘要】 目的 比较人髓系白血病细胞株HL60细胞和耐阿霉素的细胞(HL60/ADR)的整体蛋白表达谱，以期获得人髓系白血病细胞的耐药相关蛋白。 方法 提取HL60细胞和HL60/ADR细胞的总蛋白，采用荧光差异显示的双向凝胶电泳技术(DIGE)比较分析差异表达蛋白;经胶内酶解，MALDITOF/TOF质谱分析，搜索蛋白质数据库，获得差异蛋白质的信息。 结果 经过初步筛选和质谱分析共获得16个具有统计学意义的表达差异蛋白点，其中13个在HL60细胞中表达上调，3个表达下调。主要是代谢酶类、DNA修复、信号转导相关蛋白、细胞周期调节蛋白和细胞增殖与凋亡等相关的蛋白。 结论 根据人髓系白血病细胞株HL60细胞和HL60/ADR细胞的差异蛋白表达谱比较，筛选出耐药相关蛋白。

　　【关键词】 HL60白血病细胞; 白血病; 电泳，凝胶，双向; 蛋白质组学; 多药耐药相关蛋白质类

　　白血病是一组异质性造血系统恶性肿瘤，目前的治疗方法仍以化疗为主，近年来白血病的治疗已经取得了较大的进展，但是对化疗药物产生耐药依然是大多数白血病治疗失败的主要原因。多药耐药(multidrug resistance，MDR)是耐药的主要机制之一，但可能仍存在其它耐药相关机制尚未被了解[12]。为了更好地了解在耐药发生过程中蛋白质所发挥的作用，笔者应用人髓系白血病细胞株HL60细胞和耐阿霉素的HL60细胞(HL60/ADR)作为模型，采用蛋白质组学研究技术——荧光差异显示的双向凝胶电泳(two dimensional difference in gel electrophoresis,2D DIGE)比较两者间表达蛋白的差异，旨在从蛋白质整体水平对细胞耐药现象发生后产生的相关蛋白变化进行研究，探讨耐药产生的机制，为进一步寻找逆转耐药的新靶点奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 主要试剂和仪器 考马斯亮兰R350(瑞典AMERSHAM)，十二烷基磺酸钠(SDS)、甘氨酸、丙烯酰胺、TEMED(美国BioRad)。Ettan IPGphor 等电聚焦系统(瑞典AMERSHAM)，Hofer SE 600(瑞典AMERSHAM)，扫描仪(GS 710，美国BioRad)。

　　1.1.2 细胞株 人髓系白血病细胞株HL60细胞和HL60/ADR细胞引自中国医学科学院天津血液病研究所。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 2株细胞分别在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，于37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度的恒温培养箱中培养。

　　1.2.2 样品的制备和定量 收集生长良好、对数生长期的HL60细胞和HL60/ADR细胞各1×107，离心(1 000 r/min，5 min )，弃上清，加入适量的PBS洗涤，再离心(1 000 r/min，5 min )，重复3次，获得洗涤后的细胞。每管加入200 μL DIGE 裂解缓冲液[7 mol/L Urea，2 mol/L 硫脲，4% CHAPS，0.2%固相pH梯度(immobilized pH gradients,IPG)缓冲液，罗氏混合酶抑制剂]，冰浴超声破碎(80 W，每次6 s，间隔10 s，共8次，置于冰上)，然后离心(14 000 r/min，1 h)，收集上清液。使用BioRad 蛋白检测试剂测定蛋白质浓度，将2组蛋白样品分装于0.5 mL离心管中，-80 ℃低温保存。

　　1.2.3 DIGE实验 把蛋白样品浓度稀释到5 μg/μL，将所有样品等量混合，然后按50 μg/10 μL分装即成为各自的内标。取样本和内标各50 μg，分别用Cy2、Cy3、Cy5荧光染料进行标记(按每50 μg样品标记400 pmol染料)。将上述3个标记好的样品混合，进行等电聚焦电泳(IEF)，pH为3～10，13 cm非线性胶条。电泳条件：30 V 12 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，8 000 V 6 h，500 V 4 h。等电聚焦完毕后，将IPG胶条置于平衡液中平衡后，进行第二相电泳。十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDSPAGE)胶浓度为12.5%，每块凝胶先用15 mA 电泳20 min，再用30 mA电泳至溴酚蓝离胶下沿0.5 cm左右即可结束电泳，注意始终要避光。

　　1.2.4 凝胶图像扫描及软件分析 使用Typhoon扫描仪，分别采用3种不同的波长488 nm (Cy2)、532 nm (Cy3)、633 nm (Cy5)进行扫描，获得图谱。用DeCyder 5.0 分析软件(GE 公司)分析结果，得到平均比值>1.2的差异点。

　　1.2.5 蛋白差异点的酶解和鉴定 电泳完毕，将凝胶用考马斯亮兰染色后，切下蛋白差异点用胰酶进行胶内酶解20 h，抽提酶解肽段，经Zip Tip脱盐后，进行MALDITOF/TOF质谱，软件分析数据，鉴定蛋白质。

　　1.3 统计学处理 蛋白质表达谱的差异用Student′s t 检验。

　　2 结 果

　　2.1 DIGE凝胶图谱 通过双向凝胶电泳，在HL60细胞和HL60/ADR细胞的差异表达蛋白DIGE凝胶图谱中可见所表达的蛋白点数多，分布均匀且清晰，经过DIGE标记，筛选出在HL60细胞和HL60/ADR细胞之间表达差异的蛋白点，可以用于下一步的质谱分析(图1)。

　　2.2 MALDITOF/TOF质谱鉴定 切下HL60 绿色框内为差异蛋白点的位置;黄色框内为差异蛋白点的编号.

　　细胞和HL60/ADR细胞的差异蛋白点进行酶解，采用质谱分析技术MALDITOF/TOF鉴定，差异蛋白点的性质见表1。表1 经MALDITOF/TOF质谱鉴定的差异表达蛋白

　　2.3 差异表达蛋白质的归类 经过初步筛选和质谱分析共得到18个表达差异的蛋白点，其中有2个差异蛋白点经鉴定属于同一种蛋白质(蛋白点940和955同为mutant betaactin，蛋白点1 536和1 538同为nucleolar phosphoprotein B23)，因此，通过比较HL60细胞和HL60/ADR细胞的差异蛋白表达，最终得到16个具有统计学意义的表达差异蛋白点(均P<0.001)，其中13个在HL60/ADR细胞中表达上调(以“+”号表示)，3个表达下调(以“-”号表示)。它们主要是代谢酶类以及与DNA修复、细胞信号转导、细胞周期调控、细胞增殖和凋亡有关的蛋白质。

　　3 讨 论

　　MDR是指肿瘤细胞在接触一种抗肿瘤药产生耐药性后，对未接触过的、结构不同、作用机制各异的其他抗肿瘤药物也具有交叉耐药性，导致联合化疗失败。因此，MDR已成为白血病化疗失败、疾病复发的一个主要根源。近年来，探索MDR产生的机制及针对各种MDR机制所进行的耐药逆转策略，已经成为近年国内外研究的热点之一。白血病等肿瘤细胞耐药性的产生实际上是肿瘤细胞对抗细胞毒药物的损伤作用，维持自身稳定的一种防御机制;从分子水平看，肿瘤细胞耐药性的形成是由于与耐药性有关的一系列基因被诱导表达所致[12]。

　　蛋白质组学是以整体蛋白质作为研究对象，为寻找耐药相关蛋白提供了一个全新的手段[34]。笔者所应用的DIGE技术是在2DE技术基础上发展起来的定量分析凝胶上蛋白点的新方法，用于比较和分析实验组与对照组蛋白表达的差别，在重现性和灵敏度方面都优于2DE技术。DIGE的原理是将要比较的2种蛋白质样品分别用不同波长的DIGE荧光染料(Cy2、Cy3、Cy5)进行共价标记，将2个试验样品与1个内参标同时在一块凝胶上进行电泳分离，内参标的应用将有助于减少不同凝胶之间的差异，所得到的2D胶的图像经不同波长激光扫描后，得到不同颜色的荧光信号，并根据这些信号的比例来判断样品之间蛋白质的差异，这样既可避免匹配时出现的误差，在进行定量分析时也不依赖于胶与胶之间的差异[56]。同时，DIGE第一次引入了内参标的概念，也是目前唯一用内标来衡量每一块胶上每一个点的系统，由于每个蛋白点都有它自己的内标，并且分析软件会根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准，以确保DIGE定量结果的准确性、可靠性和操作的重复性。除此之外，在灵敏度方面， DIGE可与银染和SYPRO Ruby 相媲美,它可以对微量(少到5 μg)样本进行蛋白质组学分析，也可以检测到样品间<10%的蛋白表达差异，统计学可信度达到>95%[7]。目前，DIGE技术已经成为具有较好应用前景的定量蛋白质组学的研究方法。笔者应用DIGE差异蛋白质组学技术, 对人髓系白血病细胞株HL60细胞和HL60/ADR细胞的整体蛋白表达谱进行了比较，结果发现18种蛋白表达改变，其中有些可能参与耐药机制的发生。

　　通过本实验筛选出的表达下调的差异蛋白有：(1)L丝束蛋白。Verrills等报道，L丝束蛋白在长春新碱耐药细胞株中表达下调[8]。这可能与其参与细胞的DNA修复功能有关。(2)myc上游结合元件蛋白。通过结合到myc启动子上游元件而调节myc的表达。(3)CGI46蛋白。具有ATPase活性，可以调节cmyc和E2F1依赖性的细胞凋亡[9]。而表达上调的差异蛋白主要有：(1)核仁素。核仁素断裂或表达下调可以使它对bcl2 mRNA的稳定作用减弱，或者通过断裂片段直接激活核酸内切酶，使DNA发生断裂，诱导细胞凋亡。核仁素在细胞凋亡中的作用越来越突出，已被列为细胞凋亡相关蛋白中的一员[10]。(2)钙网蛋白前体(CRT)。Kageyama等发现，大鼠H9c2成肌细胞过表达CRT，DNA双链断裂增加，Akt信号转导途径明显受抑制，促进分化依赖性细胞凋亡[11]。(3)线粒体丝氨酸蛋白酶体Htra 2。具有酪氨酸蛋白酶活性，能通过结合并抑制凋亡蛋白抑制物(BIRC)，提高caspase活性而诱导凋亡[12]。(4)泛素羧基末端酯酶L3。参与泛素化蛋白的加工。(5)ATP合成酶。ATP合成酶A链和线粒体ATP酶亚单位6对维持线粒体跨膜电位有重要作用，下调可使线粒体跨膜电位下降，活化caspase3，导致细胞凋亡。(6)核仁磷酸蛋白B23。主要参与核蛋白体的装配和转运，并且增强B23的稳定性可以提高它对细胞的抗凋亡的作用[13]。(7)Nm23蛋白。可增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[14]。

　　(致谢：蛋白质组学研究内容在中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组分析研究中心完成，特此表示感谢!)

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