OD-PTD融合蛋白对K562细胞的作用

　　作者：叶盛开，陈 丽，刘宇鹏，刘丽娟 作者单位：(解放军第210医院 呼吸内科，辽宁 大连 116021)

　　【摘要】 目的 研究OD-PTD融合蛋白对K562细胞的作用。方法 应用细胞计数的方法研究OD-PTD融合蛋白对K562细胞的生长曲线的影响;用MTT研究OD-PTD融合蛋白对K562细胞的细胞毒作用;用流式细胞仪技术研究OD-PTD融合蛋白对K562细胞周期的影响。结果 OD-PTD融合蛋白能显著抑制细胞的生长(P<0.01);并且对K562细胞具有明显的细胞毒作用(P<0.01)。OD-PTD融合蛋白作用于K562细胞后,细胞周期变化明显,细胞从G0/G1期到S期发生明显阻滞(P<0.05)。结论 OD-PTD融合蛋白对K562细胞有明显的抑制作用，为进一步探讨慢性粒细胞白血病新的治疗手段提供了实验依据。

　　【关键词】 寡聚化结构域;K562细胞;细胞周期;增殖

　　Effects of OD-PTD Fusion Protein on K562 Cells

　　Ye Sheng-kai, Chen Li, Liu Yu-peng, Liu L-juan (Department of Respiratory Medicine, PLA No.210 Hospital, Dalian 116021, China)

　　Abstract： Objective To explore the effects of OD-PTD fusion protein on K562 cells.Methods Proliferation ability of K562 cells treated by OD-PTD fusion protein was studied by growth curve. The cytotoxicity of OD-PTD fusion protein to K562 cells was determined by MTT assay. K562 cells’ cycle change induced by OD-PTD fusion protein was investigated by flow cytometry. Results OD-PTD fusion protein significantly inhibited the growth of K562 cells, and it had a remarkablely cytotoxic effect on K562 cells. After several hours of exposure to OD-PTD fusion protein, the progression of cell cycle was arrested from G0/G1 to S phase. Conclusion OD-PTD fusion protein can significantly inhibit the proliferation of K562 cells, which provides an experimental basis for new therapy of chronic myeloid leukemia.

　　Key words： oligomerization domain; K562 cell; cell cycle; proliferation

　　慢性粒细胞白血病是起源于骨髓多能造血干细胞的恶性增殖性疾病，其细胞遗传学特征是具有 Ph染色体，编码具有酪氨酸激酶活性的BCR/ABL融合癌蛋白，此蛋白直接导致慢性粒细胞白血病的发生[1~3]。寡聚化结构域是BCR/ABL融合癌蛋白N端的一个重要的结构域，它介导BCR/ABL融合癌蛋白多聚体的聚合作用，进而活化BCR/ABL融合癌蛋白的酪氨酸激酶活性[4]。因此，如果利用外源性的寡聚化结构域蛋白进入细胞内，干预内源性BCR/ABL融合癌蛋白的聚合，抑制其蛋白酪氨酸激酶的活化，就有可能达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 　OD-PTD 融合蛋白是通过原核系统可溶性表达并纯化;1640培养基，Gbico公司产品;K562细胞系由第四军医大学医学遗传学和发育生物学教研室传代培养。细胞周期检测试剂盒及FACScan是美国BD公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 利用光学显微镜观察OD-PTD融合癌蛋白对K562细胞形态的影响 取对数生长期的K562细胞5×104置于25 ml 的培养瓶中，同时加入OD-PTD融合蛋白至终浓度5 g/L，对照组加等体积的培养液，连续培养24 h。以瑞士吉姆萨染色，光学显微镜观察。

　　1.2.2 用细胞计数法研究OD-PTD融合蛋白对K562细胞生长曲线的变化 取对数生长期的K562细胞以7×104置于25 ml 的培养瓶中，同时加入OD-PTD融合蛋白至终浓度5 g/L，对照组加等体积的培养液，连续培养36 h。分别在12、24、36 h 以台盼蓝染色法计算活细胞数，取平均值，绘制生长曲线。

　　1.2.3 采用MTT比色法研究OD-PTD融合蛋白对K562细胞的细胞毒作用 将对数生长期的K562细胞以每孔1×104加入96孔培养板中，每孔分别加入10 g/L OD-PTD融合蛋白50 μl，每孔设3个复孔，分别培养12、24和36 h 后，每孔加入MTT 100 μl(1g/L)，作用4 h，用PBS洗涤后，分别加入DMSO 100 μl，孵育30 min，在酶标仪570 nm 处测吸光度A值，按以下公式计算杀伤率：杀伤率(%)=(对照孔A值-实验孔A值)/对照组A值×100%。

　　1.2.4 利用流式细胞仪检测OD-PTD融合蛋白对K562细胞周期的影响 收集经过5 g/L OD-PTD融合蛋白处理后的K562细胞，用PBS洗涤后，加入10 g/L RNA酶溶液200 μl，37 ℃ 水浴15 min，加入碘化丙啶(PI)，上流式细胞仪检测细胞周期，资料均经软件收集、贮存和分析。

　　1.3 统计学方法 用SPSS10.0统计软件包进行数据分析，组间比较采用χ2检验，差异显著性检验P<0.05。

　　2 结果

　　2.1 OD-PTD融合蛋白对K562细胞形态的影响 经过OD-PTD融合蛋白处理后的K562细胞以瑞士吉姆萨染色，光学显微镜观察。对照组无明显变化，处理组可见细胞出现退行性改变：细胞淡染，体积增大，细胞膜变薄，细胞核松散。

　　2.2 OD-PTD融合蛋白对K562细胞生长曲线的影响 在12、24、36 h 时与对照组相比较，其MTT吸光度值明显降低，差异具有显著的统计学意义(P<0.01)，如图1。表明OD-PTD融合蛋白能明显抑制K562细胞生长，随着作用时间的延长，抑制作用更加明显(P<0.01)。

　　图1 OD-PTD融合蛋白对K562细胞生长曲线的影响

　　2.3 OD-PTD融合蛋白对K562细胞的细胞毒作用 5 g/L OD-PTD融合蛋白作用于K562细胞，12、24、36 h 杀伤率分别为22.4%、64.8%、95.4%(如表1)。表明OD-PTD融合蛋白对K562细胞有很强的细胞毒作用，随着时间延长，细胞毒作用也明显增强(P<0.01)。表1 OD-PTD融合蛋白对K562细胞的细胞毒作用

　　2.4 OD-PTD融合蛋白对K562细胞周期的影响 经过5 g/L OD-PTD融合蛋白作用24 h 后，K562细胞的细胞周期变化很明显。G0/G1期细胞比率从58.94%上升到73.97%(P<0.05);S期细胞比率从25.36%下降到7.23%(P<0.01) ，详见表2。表明K562细胞从G0/G1期到S期发生明显阻滞。 表2 OD-PTD融合蛋白对K562细胞周期的影响

　　3 讨论

　　随着对BCR/ABL融合癌蛋白的结构和功能的不断研究，人们逐渐认识到在不同的结构域水平对该蛋白的结构和功能进行干预, 同样也可以抑制BCR/ABL融合癌蛋白的酪氨酸激酶的活性。在新近的研究中发现，用插入诱变的方法破坏BCR/ABL融合癌蛋白N端的寡聚化结构域，能够明显抑制BCR/ABL融合癌蛋白的聚合作用，使BCR/ABL融合癌蛋白丧失酪氨酸激酶的活性，进而其诱发白血病发生的能力大大降低[5]。此外，有研究表明同源的小分子多肽可以干预蛋白质的功能，甚至可以作用于结构域的寡聚化[6]。因此，我们合成BCR/ABL融合癌蛋白N端的寡聚化结构域融合蛋白，并利用融合蛋白中的蛋白转导结构域(PTD)介导该融合蛋白的跨膜转运[7]，通过进一步研究表明，该结构域蛋白进入细胞后，对K562细胞有明显的抑制作用，为探索慢性粒细胞白血病新的药物作用靶点和新的治疗药物奠定了一定的实验基础。

　　【参考文献】

　　[1] Charles L,Sawyers CL.Chronic Myeloid Leukemia[J].New Engl J med,1999,340(17):1330-1340.

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　　[4] Zhao X,Ghaffari S,Lodish H,et al.Structure of BCR-ABL oncoprotein oligomerization domain[J].Nat struct biol,2002,9(2):117-120.

　　[5] McWhirter JR,Galasso DL,Wang JY.A coiled-coil oligomerization domain of Bcr is essential for the transforming function of BCR/ABL oncoproteins[J]. Mol Cell Biol,1993,13(12):7587-7595.

　　[6] Degterev A, Lugovskoy A, Cardone M, et al. Identification of small-molecule inhibitors of interaction between the BH3 domain and Bcl-xL[J]. Nat Cell Biol，2001,3(2):173-182.

　　[7] 梁英民,叶盛开,贾洪霞,等.PTD-BCR/ABL-OD融合癌蛋白的表达和跨膜转运[J].中华血液学杂志,2005,26(6):373-374.