(1,3)βD葡聚糖检测恶性血液病患者侵袭性真菌感染

　　作者：冷 芸 陈文明 刘晋玮 作者单位：(首都医科大学附属北京朝阳医院血液科，北京 100020)

　　【摘要】 目的 评价(1,3)βD葡聚糖〔(1,3)βDglucan，BG〕检测作为侵袭性真菌感染(IFI)快速检测方法，在恶性血液病患者IFI早期诊断中的意义。方法 选取体温≥38℃持续96小时以上，经合理的广谱抗生素治疗无效，或起初治疗有效但随后体温再次升高，1 w内未应用抗真菌药物治疗的恶性血液肿瘤患者39例为研究对象。每周进行2次血清BG检测，连续监测3 w。用统计学方法计算BG试验在早期诊断中的敏感性、特异性、阳性预测值(PV+)、阴性预测值(PV)。同时连续检测血清真菌抗原浓度变化，观察其与疾病进展和预后间的关系。结果 39例入组患者中，31例为临床诊断IFI， BG试验的阳性率为93.5%(29/31)(切点值80 pg/ml),敏感性为93.5%，特异性75%，PV+93.5%，PV75.0%，Kappa=0.685。首次血清BG阳性结果出现于临床诊断前17 d～临床诊断后2 d，平均出现于临床诊断前(2.7±3.3)d。抗真菌治疗过程中，血清BG水平在感染恶化患者持续升高，在治疗好转患者中明显下降。结论 作为IFI诊断方法， BG试验结果与临床IFI诊断具有很好的一致性;与传统培养方法相比，具有早期、快速、敏感性和特异性高的优点。

　　【关键词】 侵袭性真菌感染;;(1,3)βD葡聚糖;特异性;敏感性

　　随着接受大剂量化疗、干细胞移植治疗的恶性血液病患者逐年增加，侵袭性真菌感染(invasive fungal infection，IFI)的发病率呈明显的上升趋势，近年大样本统计已达到6%，诱导缓解期中性粒细胞缺乏后的发生率高达43%，已成为主要死因之一〔1，2〕。传统真菌检测方法检出率较低、检出时间滞后。真菌抗原检测(1,3)βD葡聚糖〔(1,3)βDglucan，BG〕试验具有快速简便的特点，有望成为新的诊断依据。本研究对BG试验诊断IFI的临床可靠性和诊断时相以及对老年患者的诊断意义进行了进一步探讨。

　　1 材料与方法

　　1.1 临床资料 入选标准：(1)患者体温≥38℃持续96 h以上，经合理的广谱抗生素治疗无效，或起初治疗有效，但体温下降后再次升高;(2)患者在BG检测前1 w内未应用过抗真菌药物治疗;(3)在患者接受抗真菌治疗前至少留取1次血清标本进行检测，且患者连续监测3 w。从2008年1月至2009年3月我院收治的恶性血液肿瘤患者730例次，符合上述入组标准(拟诊IFI病例)的39例。根据2007年我国血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌感染的诊断标准与治疗原则(修订版)〔3〕，其中31例均符合IFI临床诊断标准，男23例，女8例，老年患者(≥60岁)14例，年龄61～80〔平均(69.1±6.4)〕岁;中青年患者17例，年龄14～56〔平均(44.9±11.8)〕岁。8例最终除外IFI的患者中，6例为细菌感染，2例为结核感染，其中2例血清BG试验阳性。

　　1.2 相关检测 入组患者每周进行2次痰涂片镜检，血、痰、尿标本的细菌、真菌及结核菌培养;每周2次血清BG检测，连续3 w，3 w后复查X线胸片、肺高分辨CT，并随时对患者的临床症状、体征及用药后疗效进行观察记录。

　　1.3 检测方法 检测采用美国FUNGITELLTM试剂盒，通过以蛋白酶原为基础的光比色分析方法对患者血清中BG进行定性检测。患者血液经1 800～2 000 r/min离心5 min，提取血清经处理液处理后37℃恒温孵育10 min放入酶标仪中在405 nm下读取数据。切点值为80 pg/ml，若测量值>500 pg/ml需要用反应液稀释样本重新检测。

　　1.4 统计学分析 应用SPSS11.5统计软件，根据不同的数据资料进行配对χ2检验，诊断试验的评价与一致性检验(Kappa检验)，t检验，数值以x±s表示。

　　2 结 果

　　31例患者接受抗真菌感染治疗时，发热已持续时间为4～24 d，平均持续(9.1±4.6)d，老年组(8.4±2.5)d，年轻组(9.7±5.8)d。本组31例患者中， 6例粒细胞正常，25例伴粒细胞缺乏;粒细胞缺乏出现于抗真菌感染治疗前3～20天，平均(11.2±4.4)d，老年组(9.3±3.0)d，年轻组(12.9±4.9)d;持续4～37 d，平均时间(15.9±8.5)d，老年组(13.4±6.6)d，年轻组(18.1±9.7 )d。31例患者中，痰培养呈现阳性结果21例(67.7%)，包括假丝酵母菌7例，光滑念珠菌2例，白色念珠菌2例，烟曲霉菌5例，培养出两种真菌的5例。应用抗真菌药物：二性霉素B 12例，伊曲康唑14例，伏立康唑1例，两种抗真菌药物联合应用4例。应用时间1～28天，平均(15.6±6.5)d，老年组(13.6±6.3)d，年轻组(17.2±6.4)d。本组病死率 38.7%(12/31)，其中因脑出血死亡2人，老年组病死率42.9%，年轻组35.3%。IFI病死率32.2%(10/31)。

　　本组患者74.2%(23/31)出现了肺部IFI特征性影像改变，仅有1例为月晕征，9例表现为实变影，3例新月征，5例毛玻璃样改变，1例结节影，4例混合影像改变，8例未出现明确影像学改变。影像学异常出现于临床诊断前4 d至临床诊断后4 d，平均早于临床诊断(0.1±2.0) d。

　　本组31例临床诊断IFI患者进行了BG试验检测，其中阴性2例，单次阳性0例，两次以上阳性29例。本研究采用较为常用的阳性结果判定标准，即两次阳性结果(>80 pg/ml)定为阳性试验结果，则本研究中BG试验阳性29例，阳性率93.5%。以临床诊断IFI，开始应用抗真菌药物为时间基准点(即“0”)，首次BG阳性结果出现于临床诊断前17 d～临床诊断后2 d，平均出现于临床诊断前(2.7±3.3)d，其中老年组(2.1±1.9)d，年轻组(3.1±4.0)d。临床应用抗真菌药物治疗过程中，连续监测患者血清BG试验，平均值变化见图1，好转组与死亡组均数比较有显著性差异(P=0.002)。经一致性比较，BG试验的敏感性为93.5%，特异性75%，误诊率25.0%，漏诊率6.5%，总的符合率89.8%，阳性预测值(PV+)93.5%，阴性预测值(PV-)75.0%(Kappa=0.685,P=0.146)。BG试验与临床诊断标准间有较好的一致性。图1 好转组与死亡组血清BG试验数值随时间变化曲线

　　将本组31例患者血清BG试验与痰真菌培养结果进行配对χ2检验，二者共阳性20例，共阴性1例，仅BG试验阳性9例，仅痰培养阳性1例，即血清BG试验的阳性率(29/31)高于痰真菌培养(21/31)(P=0.021)。此外，痰真菌培养阳性结果出现的时间为-1～8 d，平均(2.7±2.2)d，BG试验阳性结果出现的时间明显早于痰真菌培养阳性结果出现时间(P=0.000)。

　　3 讨 论

　　真菌感染的确定诊断需要组织病理学的证据，而恶性血液病患者在化疗后及异基因骨髓移植术后经常出现严重的粒细胞缺乏和血小板减少，无法耐受组织活检。传统真菌检测方法的检出率低，例如痰培养的检出率仅为8%～34%〔4〕，检出时间滞后，影响了患者的早期诊断与治疗，导致死亡率居高不下。

　　真菌抗原检测是目前IFI研究的一个热点，主要包括BG检测和GM检测。除曲霉菌和念珠菌外，BG试验还可以检测一些少见的真菌，如镰刀菌、毛孢子菌、支顶孢属和酵母菌，与GM试验相比可以检测更为广谱的真菌感染。但对隐球菌感染、口腔念珠菌感染和定植的真菌，BG试验不敏感。对于念珠菌属感染，BG的敏感性为77.4%～100%不等，IFI感染时，血清BG试验的敏感性55%～100%，特异性52%～100%。敏感性和特异性的不同与试验设定的界值有关〔5，6〕。BG试验界值设为60pg/ml 检出率高，特异性降低;若界值设为120 pg/ml 检出率则过低，因此大多数研究将界值设定为80 pg/ml。本研究得出的BG试验结果与临床诊断标准间无显著差异，但首次BG阳性结果出现的时相明显早于临床诊断时间，平均出现于临床诊断前(2.7±3.3)d，对于早期诊断IFI具有很好的临床应用价值。本研究将老年患者与年轻患者进行分组比较，结果显示老年患者从出现粒细胞缺乏到临床诊断IFI的时间明显短于年轻患者，这从一个侧面表明老年患者出现IFI后，症状更加明显，进展更为迅速。因此，尽早诊断IFI在老年患者显得尤为重要。而且本研究中BG试验的阳性结果重复性强，全部为两次阳性。本研究中2例患者血清BG试验假阳性，1例为化疗后患者，1例为干细胞移植术后患者，移植前接受放疗。BG试验假阳性的可能原因为肠道真菌的定植，黏膜屏障破坏。

　　本研究结果显示，患者血清BG浓度与其病情进展也有一定的相关性。31例临床诊断IFI患者，治疗有效组进行连续血清BG检测，血清BG浓度在治疗后1～2 w呈现下降趋势，而死亡组患者的血清BG浓度则表现出明显升高趋势;两组比较有显著性差异。部分抗真菌治疗有效的患者3 w后血清BG仍大于80 pg/ml，提示我们抗真菌治疗需要很长时间，一些学者认为抗真菌治疗需要半年至1年，目前国内外对于抗真菌治疗的疗程还未达成共识。ISDA指南推荐应当在患者中性粒细胞恢复后，用药至患者临床症状、体征消失。对于真菌血症的患者抗真菌治疗可根据血清BG水平持续2～3 w，对于临床诊断/确诊患者常需要3～6个月。当患者接受抗真菌治疗后血清BG水平仍持续升高，则提示我们是否需要更换抗真菌药物或联合应用两种抗真菌药物。因此对于IFI高危患者进行连续血清BG水平监测，将有益于患者病情监测及药物的调整，同时血清BG持续升高也预示患者预后较差。

　　肺部高分辨CT检查可以帮助诊断IFI，比较公认的特征性影像为月晕征， 33%～60%的IFI患者可出现月晕征，这一特征性影像改变仅在真菌感染发生的最初5天内出现，其中大约75%的患者的月晕征会在1 w内消失〔7〕，因此限制了高分辨CT在IFI的早期诊断中的应用。本组74.2%的患者出现了肺部影像学改变，仅有1例为月晕征。影像学异常出现时间与临床诊断时间大致相同。本组患者的痰真菌培养阳性率较高，可能与留取标本时口腔正常定植菌影响或标本留取时污染有关。

　　【参考文献】

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　　3 中华内科杂志编辑委员会.血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌感染的诊断标准与治疗原则〔J〕.中华内科杂志，2007;46(7)：60710.

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　　7 Caillot D，Couaillier JF，Bernard A,et al.Increasing volume and changing characteristics of invasive pulmonary aspergillosis on sequential thoracic computed tomography scans in patients with neutropenia〔J〕.J Clin Oncol，2001;19(1)：2539.