rhEPO和rhGCSF对小鼠CD90+细胞的动员作用

　　作者：郑芳， 陈龙， 程范军， 刘岐焕， 张有顺 邹灿 作者单位：1武汉大学人民医院血液科，湖北 武汉 430060;2郧阳医学院附属东风医院2血液科;3实验中心,湖北 十堰 442008

　　【摘要】 目的:探讨重组人促红细胞生成素(rhEPO)和重组人粒细胞集落刺激因子( rhGCSF)对小鼠外周血CD90+细胞的动员作用。方法:30只雄性昆明小鼠随机分为对照组、rhGCSF组和rhEPO组。rhGCSF 40 μg·kg-1·d-1、rhEPO 250 IU·kg-1·d-1连续皮下注射5 d;对照组连续皮下注射生理盐水。每组均于最后一次注射后6 h收集外周血，计数有核细胞(ANC)和单个核细胞(MNC)，流式细胞仪检测外周血ANC中CD90+、CD34+CD90+和CD90+CD34-细胞的比例。结果:应用rhGCSF和rhEPO动员后，小鼠外周血中ANC和MNC的数量均较对照组增加(P<0.05)，但rhGCSF和rhEPO两组之间无差异(P>0.05)。流式细胞术检测显示rhEPO组外周血ANC中CD90+细胞比例为(56.49±9.06)%，较rhGCSF组明显增加(P<0.05);而rhGCSF组和对照组CD90+细胞占ANC的比例无明显差异(P>0.05)。rhEPO组的CD90+CD34-细胞比例增至(53.5±8.9)%，占CD90+细胞中绝大多数。结论:rhEPO和rhGCSF均有较强的造血干细胞动员能力，但rhEPO对CD90+细胞的动员作用强于rhGCSF，提示rhEPO对早期造血干细胞可能具有更强的动员作用。

　　【关键词】 促红细胞生成素;粒细胞集落刺激因子;动员;外周血;造血干细胞

　　Effects of rhEPO and rhGCSF on Mobilization of CD90+ Cells in Mice ZHENG Fang1,2,CHEN Long3,CHENG Fanjun2,LIU Qihuan2,ZHANG Youshun3，ZOU Can3 (1Department of Hematology,Renmin Hospital,Wuhan University,Wuhan,Hubei 430060;2Department of Hematology;3Department of Experimental Center,Dongfeng Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442008,China)

　　Abstract:Objective To investigate effects of recombinant human erythropoietin(rhEPO) and recombinant human granulocyte colony stimulating factor(rhGCSF) on mobilization of CD90+ cells in mice,and compare their mobilization efficiency.Methods Thirty male Kunming mice were randomly divided into control,rhGCSF and rhEPO groups.The mice were subcutaneously injected with rhGCSF in a dose of 40 μg·kg-1·d-1,rhEPO in a dose of 250 IU·kg -1·d-1 or saline for 5 days,respectively.The peripheral blood were collected at six hours afer the final injection,the number of absolute nuclear cells (ANC) and mononuclear cells (MNC) were counted,the proportion of CD90+,CD34+CD90+ and CD90+CD34- cells in ANC was detected by flow cytometry.Results Compared with control group,the number of ANC and MNC in peripheral blood were increased in both rhGCSF group and rhEPO group (P<0.05),but there was no significant difference between rhGCSF and rhEPO group (P>0.05).The proportion of CD90+ cells in rhEPO group was (56.49±9.06)%,and significantly increased than that of rhGCSF group (P<0.05);while the proportion of CD90+ cells in ANC had no significant difference between rhGCSF group and control group (P<0.05).The proportion of CD90+CD34- in rhEPO group was increased to (53.5±8.9)% and was accoutable for the majority of CD90+ cells.Conclusion Both rhGCSF and rhEPO have a strong ability of hematopoietic stem cells mobilization,the mobilization effect of rhEPO was more greater than rhGCSF in CD90+ cells mobilization,which suggests that rhEPO could mobilize primitive hematopoietic stem cells more effectively.

　　Key words: Erythropoietin;Granulocyte colony stimulating factor;Mobilization;Peripheral blood;Hematopoietic stem cells

　　外周血造血干细胞移植(peripheral blood hematopoietic stem cell transplantation,PBSCT)广泛用于恶性血液病、实体瘤及自身免疫性疾病的治疗。许多因素如原发病、患者年龄、预处理方案等影响移植后的临床经过，但移植物的质量是影响预后的关键因素之一。目前，临床移植过程中一直将CD34+视作造血干细胞(HSC)/造血祖细胞(HPC)的表面抗原标志用于评价移植物的质量。但CD34+细胞群是不均一的细胞群体，其中90%～95%同时表达系列相关抗原标志，而具有长期造血重建与免疫重建的造血干细胞仅占CD34+细胞的1%～2%，故分化抗原CD34并非是判断HSC最佳的指标。新近确定了几种特定表达在干细胞和早期祖细胞的抗原，如CD90(Thy1),CD133,KDR受体和信号调节蛋白(SIRPs)，其中CD90被认为是HSC的又一标志性抗原，在造血干祖细胞分化发育过程中CD90先于CD34分子出现，在早期HSC中表达[1]，这可能对造血干祖细胞的研究提供新的途径和新的方法。

　　籍此，本课题组观察了使用rhEPO和 rhGCSF后小鼠外周血中有核细胞、单个核细胞和CD90+细胞的变化，以探讨rhEPO和 rhGCSF对小鼠CD90+细胞的动员作用 ,探索可获得富含CD90+细胞的PBSCT移植物的方法,为临床进一步改善外周血造血干细胞移植移植物应用提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物:SPF级雄性昆明种小鼠30只, 2月龄，体重20～25 g ,郧阳医学院实验动物中心提供,动物合格证号:SCXK(鄂) 2003-0005 。

　　1.1.2 试剂与仪器:rhGCSF(齐鲁制药有限公司生产,批号:20080826);rhEPO(沈阳三生制药有限责任公司生产，批号：20070905V)。FITC标记的抗小鼠CD90单克隆抗体,PE标记的抗小鼠CD34;同型对照为 FITC标记的小鼠IgG2α,PE标记的小鼠IgG2α,红细胞裂解液(均购自eBioscience公司)。流式细胞仪(美国BD公司)。

　　1.1.3 实验分组:30只昆明小鼠随机分为3组,每组10只。设对照组、rhGCSF组及rhEPO组,分别给予等量生理盐水、rhGCSF 40 μg·kg-1·d-1和rhEPO 250 IU·kg-1·d-1皮下注射,连续5 d,最后一次注射后6 h采集外周血。

　　1.2 方法

　　1.2.1 外周血ANC和MNC计数:用10%的水合氯醛麻醉小鼠，采集外周血,在含肝素钠的抗凝管中充分混匀;取抗凝血10 μL，加白细胞稀释液0.19 mL混匀，加入血球计数板中，置低倍镜下计数有核细胞总数(ANC)，具体方法参见文献[2]。将采集的外周血进行涂片，瑞氏染色后,油镜下分类，计数单个核细胞(MNC)。

　　1.2.2 流式细胞仪检测细胞表面标志:取标本血100 μL,分别加入抗小鼠CD34、CD90抗体,FITC 标记的小鼠IgG2α、PE 标记的小鼠IgG2α同型对照，充分混匀，置4 ℃下避光孵育30 min,红细胞裂解液裂解5 min;1 500 r/min离心5 min,弃上清，PBS冲洗;重复2次,流式细胞仪检测抗原的表达情况，并分析其所占比例。

　　1.3 统计学分析

　　采用SPSS 11.5软件包,数据以均数±标准差(x±s)表示。组间比较单因素方差分析、方差齐性分析、两样本t检验,以P<0.05为显著性差异。

　　2 结果

　　2.1 外周血ANC和MNC计数

　　rhEPO和rhGCSF组动员后，两组外周血中ANC分别上升至(25.67±2.31)×109 /L、(21.3±2.93)×109/L;MNC分别上升至(19.79±1.57)×109/mL、(16.09±3.17)×109/mL ,均显著高于对照组的(7.13±1.12)×109 /L和(4.28±1.08)×109 /L(P<0.01)，但rhEPO组和rhGCSF组之间无统计学差异(P>0.05)。

　　2.2 流式细胞仪检测CD90+细胞结果

　　应用rhGCSF和rhEPO动员后，流式检测显示：两组CD90+细胞比例(为CD34+CD90+和CD90+CD34-细胞比例之和)分别上升至(56.49±9.06)%和(1.31±0.60)%。rhGCSF组和对照组CD90+细胞的比例无差异(P>0.05);而rhEPO组比对照组、rhGCSF组明显增加(P<0.05)。rhEPO组中CD34+CD90+和CD90+CD34-细胞比例均增加，且CD90+CD34-细胞高达(53.5±8.9)%，占绝大多数(见表1和图1)。 表1 rhEPO和rhGCSF动员小鼠外周血注：与rhGCSF组相比,*P<0.05

　　3 讨论

　　据国际骨髓移植登记组(international bone marrow transplantation registry,IBMTR)的报道，2007年全球有超过45 000 例患者接受了PBSCT，90%的自体造血干细胞移植和50%的异基因造血干细胞移植采用外周血干细胞(PBSC)为移植物[3]。移植物中含有HSC和各期HPC、各阶段的增殖细胞以及成熟血细胞,它们继续增殖分化或完成一定功能后自终,但只有HSC能在受者体内植活并担任长期重建造血与免疫重建的任务。至今还未发现有关HSC的特异形态学特征,因此多利用其表面特异性抗原标志来进行鉴别。

　　CD34+是人们普遍认同的HSC/HPC的代表性表面标志,常用于衡量动员后PBSCT移植物的质量;但CD34+细胞中90%以上是HPC,极少部分为HSC。一些学者认为,CD34-的HSC可能比表达CD34的HSC更原始,且能够能转化成CD34+细胞，并能保持其功能[1,4]。从发育生物学看,CD34分子从无到有,然后从有到无,反映了HSC的产生、发育、分化和成熟。因此要评价移植物中HSC的含量可能还需其它更精准的抗原标志。CD90是新近确定的造血干细胞标志，在造血干祖细胞分化发育过程中先于CD34分子出现，在人和啮齿类动物的骨髓、胎肝和脐血中的早期造血干细胞表达;富集CD90+细胞植入SCID小鼠体内不仅能快速重建造血，而且可维持长期造血[1]。这表明CD90+细胞是一群能重建骨髓造血功能的早期HSC。临床实验证实富集的CD90+细胞移植后，不仅能和富集的CD34+细胞一样能快速植入，重建造血，还有利于维持嵌合体的长期存在[5]。因此CD90也可作为评价动员后移植物质量的抗原标志。

　　本实验结果显示：rhEPO动员CD90+细胞的比例明显高于rhGCSF，提示rhEPO比rhGCSF能更有效的动员早期HSC，有利于改善移植物的质量。虽然EPO是最早用于临床的重组造血生长因子，但有关用于PBSC动员的文献甚少，且多和GCSF或GMCSF联合使用。Pierelli等[6]对50例ⅢB/ⅢC或IV期卵巢癌患者采用EPO联合GCSF动员，结果显示EPO联合GCSF不仅能提高PBSC的动员效率，而且动员的PBSC移植后能迅速重建各系造血，尤其能显著降低致死性血小板减少症，明显改善病人预后。可能的机制之一为EPO除能动员多系祖细胞外，还具有较强的HSC动员能力。

　　由于种系之间HSC的表面标志也存在差异，通常人和灵长类动物的HSC标志为CD34、CD133、CXCR4和CD150;而小鼠的表达CD90、Scal1、ckit[7]。Matsuoka等[8]在分析小鼠CD34的过程中发现,在不同成长时期其表型不同,胎鼠、新生鼠、成年幼鼠的造血组织中大部分为LincKit+ CD34+ 的HSC,而在7周龄后出现CD34- HSC,随后不断增加,到10周龄时主要是CD34- HSC。由此推断CD90+CD34-细胞为成年幼鼠的一群早期HSC，与Lange及Pearce等学者的结论相似。Lange等[9]从小鼠外周血中分离了一群单核细胞表型为CD34-CD90+，移植入受致死量照射的小鼠体内，在15～20 d内外周血各系细胞恢复正常，他们认为这群细胞的表型和早期HSC及原始干细胞的表型是一致的。Pearce等[10]的研究证实在小鼠的骨髓中有近1/3的单个核细胞表达原始干细胞标志ckit+、Scal1+、CD90+、lin-、CD34-，而不表达各系祖细胞的标志如CD2、CD4、CD5、CD8、NK1.1等，这部分细胞可能是较早期的造血干祖细胞，能长期向各系细胞增殖、分化。本实验结果还显示在rhEPO动员CD90+细胞中，大部分为CD90+CD34-细胞，提示rhEPO能更有效的动员早期造血干祖细胞。

　　有文献报道CD34+CD90+比CD34+含有更多的长期培养启始细胞(LTCIC),LTCIC为最早期的HPC，有利于快速重建造血和维持长期造血[11]。临床研究显示CD34+CD90+与移植后长期(12个月后)的血小板，血红蛋白水平密切相关，CD90+细胞在移植长期预后中起积极作用，且相关强度高于CD34+和CD34+CD133+细胞，因此提出CD34+CD90+细胞是预测移植后长期造血的指标[12]。GCSF是被推荐的临床外周血造血干细胞移植的标准动员剂，但有部分病人即使满足了CD34+细胞移植的阈值，也不能有效的植入或植入失败，可能的原因之一是移植物中早期的HSC数量过少[13]。本研究的实验结果显示rhEPO和rhGCSF动员后的外周血中ANC和MNC数量无明显差异，但rhEPO动员的CD90+细胞的比例明显高于rhGCSF，表明rhEPO能较rhGCSF动员出更高比例的CD34+CD90+细胞，外周血造血干细胞移植动员方案中添加rhEPO有可能提高PBSCT移植物中早期造血干祖细胞的比例，可能对改善PBSCT移植物的质量起到积极作用。

　　【参考文献】

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