Survivin、COX-2、VEGF在非小细胞肺癌中表达的相关性研究

　　作者：白桂颖 李凯 作者单位：天津第三中心医院代谢血液内科，天津 300170

　　【摘要】 目的 探讨Survivin、COX-2、VEGF三种蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达及其与临床病理因素的相关性。方法 用免疫组化方法检测40例非小细胞肺癌组织中Survivin、COX-2、VEGF的表达，并与临床病理因素进行相关性分析。结果 1.三者在不同年龄、性别、病理类型中表达的差异无统计学意义(P均> 0.05)。2.Survivin、VEGF在不同的肿瘤直径、有无淋巴结及远处转移中的表达差异有统计学意义。COX-2在不同的肿瘤直径、有无淋巴结及远处转移中的表达差异无统计学意义。3.三者的表达互呈正相关。结论 Survivin、VEGF、COX-2三者相互作用，是较好的预测肿瘤负荷及其远方转移的指标。

　　【关键词】 非小细胞肺癌;Survivin;COX-2;VEGF;免疫组化

　　近年来，非小细胞肺癌(NSCLC)发病率、死亡率居高不下，晚期患者5年生存率仅为14%〔1〕。研究表明〔2～4〕反应细胞凋亡的生存素(Survivin)，反应血管生成的血管内皮生长因子(VEGF)以及前列腺素生成过程中重要的限速酶环氧化酶-2(COX-2)与NSCLC生物学行为有关，因其表达的不同，NSCLC的治疗效果及预后存在很大差异。目前，国内外鲜有关于三者在NSCLC中相关性的报道。我们采用免疫组织化学方法检测肺癌组织中Survivin、COX-2、VEGF三种蛋白的表达情况，探讨其与非小细胞肺癌生物学行为的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本 来源于天津医科大学附属肿瘤医院病理科，均为原发性非小细胞肺癌，共40例，肺癌组织取自肿块中央非坏死部分。其中鳞状细胞癌19例，腺癌16例;腺鳞癌5例;男25例，女15例，平均年龄(63.3±8.8)岁。依据1997年修订标准进行TNM分期，其中I期8例，II期 6例，III期14例，IV期12例。

　　1.2 试剂 抗Survivin、VEGF鼠抗人单克隆抗体(北京中山生物技术有限公司);抗COX-2鼠抗人单克隆抗体、SABC试剂盒(福州迈新生物技术有限公司)。

　　1.3 方法 切片依次脱腊水化后，灭活内源性过氧化物酶、热源修复、滴加一抗4℃ 过夜、依次滴加试剂A、B(生物素标记二抗、链霉卵白素 + 辣根酶标记生物素)孵育后DAB显色，苏木素轻度复染，梯度酒精脱水，中性树胶封片。PBS液代替一抗做空白对照。

　　1.4 结果判定 所有切片均采用双盲法由两位病理医生观察诊断，结果不一致的切片，由两人再次读片。Survivin、COX-2及VEGF 阳性信号为胞浆内出现黄色至棕褐色颗粒状染色。采用染色强度×染色细胞百分率综合记分方式评估。标准为:0～1分(-);1～3分(+);4～6分(++);7～9分(+++)。其中染色强度评分：浅黄色为1分 棕黄色为2分，棕褐色为3分。染色细胞百分率采取每例切片在×400显微镜下随机选取5个高倍视野计数，每个区域计数200个癌细胞，共计数1 000个细胞，计算出阳性细胞百分率，继而给出评分。阳性细胞<10%为0分，阳性细胞11%～30%为1分，阳性细胞31%～50%为阳性2分，阳性细胞>50%为强阳性3分。

　　1.5 统计学处理 采用SPSS10.0统计软件，计数资料采用χ2检验，等级资料采用Spearman相关分析。

　　2 结果

　　NSCLC患者瘤组织中Survivin、VEGF蛋白在不同年龄、性别、病理类型中表达的差异无统计学意义(P均> 0.05)，而在不同的肿瘤直径、有无淋巴结及远处转移组表达差异有统计学意义(P均<0.05)。原发肿瘤直径大于3 cm、有淋巴结转移、有远处转移者上述两种蛋白的阳性率高。COX-2蛋白的表达则在不同性别、年龄、病理分型、有无淋巴结及远处转移组中差异均无统计学意义(P>均0.05)，见表1。

　　表1 NSCLC患者肿瘤组织中Survivin、VEGF、COX-2蛋白表达与其临床病理特征的关系(略)

　　40例肿瘤标本的Survivin、COX-2、VEGF蛋白表达阳性率分别为52.5%、57.5%、65.0%。染色强度评分资料行Spearman等级相关分析，发现Survivin与COX-2、VEGF三者的表达互呈正相关。Spearman等级相关系数分别为0.468(Survivin与COX-2)、0.626(Survivin与VEGF)、0.416(COX-2与VEGF)。见表2。

　　表2 NSCLC患者肿瘤组织中Survivin、COX-2、VEGF蛋白的表达(略)

　　3 讨论

　　3.1 Survivin 属凋亡抑制蛋白家族(IAPS)，在胚胎组织和大多数肿瘤组织中呈高表达，而在正常组织和癌旁组织沉默〔5〕。本研究发现Survivin在NSCLC中有稳定的表达，其阳性率与患者的年龄、性别、病理组织学之间无关,而与TNM分期有关，分期越晚其阳性率越高，与文献报道一致〔6〕。因此，应用免疫组化方法检测肿瘤组织中这项指标可以快速识别有高复发风险的病人，从而指导进一步的治疗策略。此外，生存素在血管塑形和新生血管形成过程中具有重要意义，生存素在肿瘤血管内皮细胞中高表达而抑制内皮细胞凋亡、促进血管生成。

　　3.2 VEGF 是目前已知的作用最强的促血管生成因子，能刺激肿瘤新生血管内皮细胞增殖，促进微小静脉通透性的增加，诱导血管形成〔7〕。VEGF的表达强度与微血管密度值之间存在显著正相关〔8〕,且与其放疗敏感有关，放疗敏感的NSCLC患者VEGF表达的阳性率低〔9〕。与Survivin相同，VEGF在NSCLC中的阳性率与患者的年龄、性别、病理组织学之间无关,而与TNM分期有关，分期越晚其阳性率越高，与文献报道一致〔10〕。故VEGF及其受体(VEGFR)被认为是最有前途的抗肿瘤血管生成靶点。

　　3.3 COX-2 是花生四烯酸转化成前列腺素代谢中的限速酶,呈诱生性表达，大多数正常组织中表达极少，当细胞接受各种刺激，如细胞因子、生长因子、癌基因及促肿瘤剂的诱导后迅速合成。本研究未发现COX-2与患者的年龄、性别、病理组织学及TNM分期之间有明显关系,提示用COX-2蛋白检测进行肿瘤恶性程度、病情轻重的预测无明显价值。可能在肿瘤的进展期，由于其他肿瘤相关因子的参与，COX-2未能显示出主导地位。有待于扩大样本进一步验证。

　　3.4 Survivin、VEGF及 COX-2三者相关性 体外实验证实〔11〕用高转移肺癌细胞系试验显示出COX-2表达与肿瘤侵袭、转移的能力正相关，其抑制物可减少转移。高表达COX-2的非小细胞肺癌更表现抗凋亡特性，同时往往有恒定表达的Survivin〔12〕。利用基因或药物抑制COX-2的活性，癌细胞抗凋亡的活性及Survivin的表达量也随之下降。利用RNA干扰封闭Survivin的表达，COX-2表达并不受影响。由此推断COX-2处于Survivin的上游，调控Survivin的表达。COX-2催化产生PGE2可刺激VEGF的产生，进而促进肿瘤血管生成〔13〕。选择性的COX-2抑制剂能降低肺癌组织COX-2的表达而诱导凋亡，降低VEGF和bFGF蛋白表达水平，阻碍肿瘤的血管形成和生长，抑制瘤体的增长。NSCLC肿瘤微环境中瘤细胞和间质细胞中COX-2的表达对于上调VEGF的表达及肿瘤血管生成，具有重要作用〔14〕。VEGF还促进NSCLC的肿瘤细胞的Survivin表达〔15〕。有报道，VEGF能抵抗肿瘤坏死因子和神经酰胺对内皮细胞的凋亡诱导作用，使用寡核苷酸封闭Survivin,则能消除这种抵抗作用。相反，在缺乏VEGF的条件下这种寡核苷酸则不能抑制内皮细胞的生存能力〔16〕。

　　本组研究中，NSCLC组织中Survivin、COX-2与VEGF的阳性率互呈正相关,三者协调一致地表达。由此推断Survivin、VEGF、COX-2三者相互作用，共同参与NSCLC的发生发展。尤其Survivin与VEGF有望成为预测NSCLC远处转移很好的指标。从抗调亡及血管生成两条途径的分子机制来看Survivin、VEGF均处于COX-2作用点的下游。目前肿瘤的靶向治疗蓬勃兴起，以诱导调亡、抑制血管生成及COX-2为靶点的新药层出，并且显示了一定的疗效。检测NSCLC组织中Survivin、COX-2与VEGF表达，更便于为靶向治疗选择受益人群、预测其治疗效果以及更好的理解靶向治疗的机制。

　　【参考文献】

　　1 于世英.肺癌分子靶向治疗药物的研究进展〔J〕.医药导报,2006;25(7)：654-6.

　　2 Ulukus EC，Kargi HA，Sis B，et al.Survivin expression in non-small-cell lung carcinomas：correlation with apoptosis and other apoptosis-related proteins，clinicopathologic prognostic factors and prognosis 〔J〕.AIMM，2007;15(1):31-7.

　　3 Byers LA，Heymach JV.Dual targeting of the vascular endothelial growth factor and epidermal growth factor receptor pathways：rationale and clinical applications for non-small-cell lung cancer 〔J〕.Clin Lung Cancer，2007;8(Suppl2):s79-85.

　　4 Zhang HZ,Hua P,Li HG.Expression of vascular endothelial growth factor C and cyclooxygenase-2 in non-small-cell lung carcinoma and their clinical significance〔J〕.Zhonghua Zhong Liu Za Zhi，2005;27(12):734-7.

　　5 Ambrosini G，Adida C，Altieri DC.A novel anti-apoptosis gene survivin expressed in cancer and lympomal 〔J〕 Nat Med,1997;3(8):917-21.

　　6 Atikcan S，Unsal E，Demiraq F，et al.Correlation between survivin expression and prognosis in non-small cell lung cancer〔J〕.Respir Med，2006;100(12):2220-6.

　　7 Borgstrom P，Hillan K，Srlramarao P，et al.Complete inhibition of an.giogenesis and growth of microtumors by anti-vascular endothelialgrowth factor neutralizing antibody：novel concepts of angiostatic therapy from intravital videomicroscopy 〔J〕.Cancer Res，1996;56:4032-9.

　　8 顾宇平，束永前，张炜明，等.非小细胞肺癌中COX-2、VEGF和MVD的表达及其意义〔J〕.苏州大学学报(医学版),2006;26(4)：625-8.

　　9 Guo RP，Zhong C，Shi M，et al.Clinical value of apoptosis and angiogenesis factors in estimating the prognosis of hepatocellular carcinoma〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol，2006;132(9):547-55.

　　10 王 玲，李 霞，李 玉，等.Survivin、VEGF 的表达及微血管密度与非小细胞肺癌临床病理特征的关系〔J〕.癌症，2005;24(7)823-6.

　　11 Kozaki K，Kcdhikawa K，Tatematsu Y，et al.Muhi-faeeted analyses of a highly metastatic human lung cancer cell line NC1-H460-LNM35 suggest mimicry of inflammatory cells in metastasis〔J〕.Oncogene，2001;20(31)：4228-34.

　　12 Krysan K，Merchan FH，Zhu L，et al.COX-2-dependent stabilization of survivin in non-small cell lung cancer〔J〕.FASEB J，2004;11(18):206-8.

　　13 Von Rahden BH，Brucher BL，Langner C，et al.Expression of cyclo-oxygenase 1 and 2，prostaglandin E synthase and transforming growth factor beta1，and their relationship with vascular endothelial growth factors A and C，in primary adenocarcinoma of the small intestine〔J〕.Br J Surg，2006;93(11):1424-32.

　　14 Yuan A，Yu CJ，Shun CT，et al.Total cyclooxygenase-2 mRNA levels correlate with vascular endothelial growth factor mRNA levels，tumor angiogenesis and prognosis in non-small cell lung cancer patients〔J〕.Int J Cancer,2005;115(4):545-55.

　　15 Shi M，Guo XT，Shu MG，et al.Enhancing tumor radiosensitivity by intracellular delivery of survivin antagonists〔J〕.Med Hypotheses，2007;68(5):1056-8.

　　16 Mesri M，Wall NR，Li J,et al.Cancer gene therapy using a survivin mutant adenovirums 〔J〕.Clin Invest，2001;108(7)：981-90.