紫草素诱导白血病细胞K562凋亡的研究

　　作者：陈志炉 蒋慧芳 史亦谦 周郁鸿 作者单位：310012 浙江省立同德医院(陈志炉 蒋慧芳)　310006 浙江中医药大学附属第一医院(史亦谦 周郁鸿)

　　【摘要】 目的 探讨紫草素对人白血病K562细胞的诱导凋亡作用。 方法 MTT显色法检测紫草素对K562细胞的增殖抑制作用;形态学观察分析DNA琼脂糖凝胶电泳;Annexin V/PI双标记法检测紫草素对K562细胞的凋亡效应;Caspase检测K562细胞凋亡通路。 结果 紫草素0.25～8μg/ml浓度即能明显抑制K562细胞的增殖，并具有时间和浓度的依赖性。1μg/ml紫草素作用48h后的K562细胞出现凋亡细胞的特征。1～4μg/ml浓度紫草素诱导K562细胞凋亡具有明显的量效关系，2μg/ml紫草素在0～72h内诱导K562细胞凋亡具有明显的时效关系;DNA凝胶电泳呈现细胞凋亡的典型梯形条带;紫草素诱导K562细胞凋亡经历了Caspase-3、 Caspase-6和Caspase-9的激活。 结论 紫草素能有效地诱导K562细胞凋亡，并主要通过线粒体凋亡通路。

　　【关键词】 紫草素 K562细胞 细胞凋亡

　　【Abstrat】Objective To evaluate the apoptotic induction of shikonin on human leukemia K562 cells . Methods MTT colorimetric assay was used to examine the growth inhibition of shikonin on K562 cells. The apoptosis of K562 cells was detected by cell morphological observation, DNA agarose gel electrophoresis and Annexin V/PI double labeling. The apoptosis pathway was tested by activation of caspase. Results Shikonin significantly inhibited the growth of K562 cells in a concentration-depedent and time-dependent manner at the range of 0.25 to 8ug/ml. The K562 cells treated with 1.0ug/ml shikonin for 48 hours showed morphological characteristics of apoptotic cells; The K562 cells treated with shikonin of different concentration (1.0, 2.0, 4.0ug/ml) for 48 hours ; with 2.0μg/ml shikonin for 24, 48 and 72 hours; induction of apoptosis was associated with exposure time and concentration. There was typical ladder strap in DNA gel electrophoresis. Shikonin induced K562 cells apoptosis involved in the activation of caspase-3, caspase-6 and caspase-9. Conclusion Shikonin can induce apoptosis of human leukemia K562 cells, and the key is mitochondrial apoptosis pathways.

　　【Key words】 Shikonin K562 cells Apoptosis

　　紫草素是从紫草根中提取的萘醌类化合物，可对多种肿瘤起抑制和诱导凋亡作用[1，2]。目前国内尚无紫草素诱导白血病细胞凋亡的研究报道。作者观察了紫草素对白血病细胞的增殖和凋亡作用，并对其作用机制进行初步探讨，以为临床应用紫草素治疗白血病提供一定的实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂及药品

　　小牛血清(杭州四季青生物研究所)，RPMI 1640培养粉(Gibco)、琼脂糖(上海东海制药厂)，二甲基亚砜(DMSO，江苏洪声化工厂产品，分析纯)，3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，Sigma)、Annexin V/PI试剂盒(Bender Medsystems)、DNA提取试剂盒(上海申能博彩生物公司)，Caspases试剂盒(R&D)、紫草素(中国药品生物制品检定所)。

　　1.2 细胞培养

　　K562细胞用含体积分数为10%热灭活小牛血清(56℃，灭活30min)的RPMI1640培养基，置37℃体积分数为5%的CO2培养箱中常规培养，每2～4d传代一次，取对数生长期细胞进行实验。

　　1.3 紫草素对细胞生长抑制作用的观察

　　取对数生长期的K562细胞按5×104/ml的密度接种于96孔板，每组设6个平行孔，分别加入紫草素，使实验组的终浓度分别为0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml，对照组加入等体积的RPMI 1640培养液，置37℃、5%CO2的培养箱中培养。分别于作用24、48、72h时取出96孔板，加入5mg/ml的MTT 20μl在相同条件下继续培养4h后离心5min，吸取上清液，每孔加入DSMO 150μl，振荡20min，用酶标仪于570nm处测定各孔的吸光度值(A570)。抑制率(%)=(A对照-A实验)/A对照×100%。

　　1.4 细胞形态学观察

　　收集药物处理48h后的细胞，经磷酸盐缓冲液洗2遍后，离心、制片，Wright-Giemsa染色，油镜下观察细胞形态变化。

　　1.5 细胞DNA的提取和片段化鉴定

　　收集药物处理后K562细胞2×106。用PBS洗涤2遍，细胞悬浮于200μl TE中，加入400μl Solution CL和3μl蛋白酶K ，水浴后加入600μl氯仿，离心收集上清液，加入500μl Solution P离心，再加入100μl 1.2M Nacl和RNaseA 3μl，水浴后加入300μl无水冷乙醇，离心收集DNA，在2%的琼脂糖凝胶上电泳1～1.5h，紫外灯下摄片。

　　1.6 Annexin V/PI双标记法

　　离心收集药物处理24、48、72h后K562细胞1×106，PBS洗2次，用1：4 binding buffer缓冲液190μl重悬细胞，加入FITC(异硫氰酸荧光素)标记的Annexin V-FITC 5μl和20μg/ml PI 10μl，置冰上作用10min，用流式细胞仪检测。实验结果经Cellquest 3.1.f软件分析。

　　1.7 Caspase活力检测

　　1μg/ml紫草素作用于K562细胞48h 后收集2×106细胞，用PBS洗2遍，加入50μl cold Cell Lysis Buffer，放置在冰上作用10min，离心收集上清液，种于96孔平底板，每孔加入50μl 2×Reaction Buffer和5μl Caspase-3、6、9(VEID-pNA)， 置37℃、5%CO2的培养箱中培养1h, 用自动酶标仪测定405nm区的吸光度值(A405)。

　　1.8 统计学处理

　　采用SPSS 10.0统计软件，数据资料以(x±s)表示，两组间比较用t检验，多处理组间数据用方差分析(F检验)。以P<0.05为差异有显著性。

　　2 结果

　　2.1 紫草素对K562细胞生长的抑制作用 见图1。显示紫草素对K562细胞生长有明显的抑制作用，呈时间和剂量依赖性，和对照组相比差异非常显著性(P<0.01)。

　　2.2 凋亡细胞的形态特征

　　K562细胞经1μg/ml紫草素作用48h后，细胞出现明显的体积缩小、染色质聚集、核固缩，核碎裂等改变，少数细胞细胞质向核一侧固缩呈半月形，出现典型的凋亡改变。

　　2.3 DNA琼脂糖凝胶电泳分析

　　K562细胞经0.5～4.0μg/ml紫草素作用48h和2μg/ml紫草素作用24、48、72h后出现典型的DNA梯状条带，如图2、3。

　　2.4 Annexin V/PI检测结果

　　浓度为0 μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml的紫草素作用48h时K562细胞凋亡率分别为(1.65±0.48)%、(11.45±1.28)%、(16.17±2.13)%、(33.42±3.21)%;而2μg/ml紫草素作用K562细胞0、24、48、72时凋亡率分别为(1.33±0.81)%、(13.75±1.69)%、(16.17±2.13)%、(30.84±2.86)%;各组相比，差异有显著性(P<0.05)。实验证实紫草素对K562细胞凋亡呈剂量和时间依赖性。

　　2.5 Caspase活力检测结果

　　实验结果显示，对照组的Caspase值为0.097±0.007 ，1μg/ml紫草素作用K562细胞48h时的Caspase值分别是Caspase-3为0.743±0.026，Caspase-6为0.307±0.013，Caspase-9为0.312±0.015，加药组与未加药组相比，差异有显著性(P<0.05)，表明紫草素能明显增强Caspase的活性，且以增强Caspase-3活性为主。

　　3 讨论

　　目前治疗白血病的许多化疗药物都能诱导白血病细胞发生凋亡，细胞凋亡现象也为白血病的治疗研究提供了新的思路和靶点。现代药理研究表明许多中药具有细胞毒作用和改善体内激素水平、免疫调节、促诱导分化作用[3]。中药具有诱导细胞发生凋亡的药理学基础。紫草为紫草科植物，具有凉血活血、解毒透疹的功效，具有抗菌、抗变态反应和抗肿瘤、解热、止血、降血糖等作用[1]。紫草素是从紫草根中提取的萘醌类化合物，可对多种肿瘤，如小鼠腹水型肉瘤S180、子宫颈瘤U14等起抑制作用[1，2]。实验发现新疆紫草素可诱导大肠癌CCL229细胞凋亡，不同浓度的紫草素作用后，CCL229细胞均具有明显的凋亡特征[3];也可选择性地抑制DNA拓扑异构酶-I[4]。诱导肿瘤细胞凋亡是紫草发挥其抗肿瘤作用的机制之一。本实验发现，紫草素能明显地抑制K562细胞增殖，抑制呈时间、剂量依赖性。通过形态学、DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术等方法证实了紫草素能诱导K562细胞凋亡，并且凋亡细胞的比例与药物浓度和作用时间之间有一定的相关性。为了进一步证明紫草素对白血病细胞的诱导凋亡作用和推测其凋亡作用的通路，用Caspase试剂盒进行了检测。研究表明，凋亡发生是一个复杂的、由Caspase家族成员介导的蛋白酶级联反应过程，即凋亡信号首先活化启动性Caspase，进一步活化效应性Caspase，然后作用于底物蛋白，使蛋白分解引起凋亡。Caspase是细胞凋亡的核心。Caspase有关的凋亡通路至少有三种：死亡受体通路、 线粒体通路、内质网通路。尽管在不同细胞或同一细胞受不同刺激诱发凋亡过程中激活的Caspase不尽相同，但普遍认为Caspase-3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路。人类Caspase-3与ced-3的同源性高达35%，提示Caspase-3 是线虫ced-3在哺乳动物中真正对应者，有人称之为“死亡蛋白酶”。Caspase-3介导的凋亡在人体多种细胞中普遍存在。多种刺激因素启动的信号激活Caspase-3，使胞质、胞核及细胞骨架的重要蛋白质降解失活，可以说Caspase-3是哺乳动物细胞凋亡中的关键酶[5，6]。实验结果证实，紫草素能够通过激活Caspase，诱导白血病细胞凋亡，而且以增强Caspase-3的活性为主，因此紫草素诱导白血病细胞凋亡，主要是通过线粒体介导的凋亡通路。

　　目前可以肯定的是紫草素在体外能诱导K562细胞调亡， 为今后在临床上应用紫草素治疗白血病提供了一定的实验依据。但紫草素诱导K562细胞凋亡的具体机制，仍需进一步的研究。

　　【参考文献】

　　1 王本祥，马金凯，邓文龙，等编.现代中药药理学.天津：天津科学技术出版社，1999.349～353.

　　2 胡艳萍，王骏业.紫草素增加小鼠肝癌和Lewis肺癌治疗效应的初步研究.肿瘤防治研究,1991,18(2)：71～73.

　　3 蒋英丽，宋今丹.新疆紫草素诱导人大肠癌细胞的凋亡.癌症,2001,20(12)：1355～1358.

　　4 Ahn BZ，Baik KU，Kweon GR，et al.Acylshikonin analogues synthesis and inhibition of DNA topoisomerase-I.J Med Chem,1995,38(6)：1044～1047.

　　5Askenazi A，Dixit VM. Death receptors:signaling and modulation. Science,1998,281:1305～1308.

　　6 李小明，孙志贤.细胞凋亡中的关键蛋白酶-Caspase-3.国外医学·分子生物学分册，1999，21(1)：6～9.