鱼纲动物鲤鱼和两栖纲动物牛蛙血红蛋白自身不相互作用的研究及其进化意义

　　作者：王程 秦文斌 雎天林 　包头医学院血红蛋白研究室，内蒙古包头014010

　　摘 要 目的：研究鱼纲动物鲤鱼和两栖纲动物牛蛙血红蛋白自身的相互作用。方法：淀粉-琼脂糖混合凝胶交叉电泳。结果：鲤鱼、牛蛙的血红蛋白自身在“直接交叉”、“穿过”、“兜过”实验电泳过程中均未出现扭曲现象。结论：鲤鱼、牛蛙的血红蛋白自身不相互作用。

　　关键词 血红蛋白;鲤鱼;牛蛙;相互作用

　　A Study of Self-interaction Absence of Hemoglobin in Pisces Cyprinu Carpio and Amphibia Rana Catesbeiana and Its

　　Significance for Evolution of Species

　　WANG Cheng，QIN Wenbin，JU Tianlin

　　(Laboratory of Hemoglobin，Baotou Medical College，Baotou 014010,China)

　　Abstract Objective: To study the self-interaction of hemoglobin in Pisces Cyprinus carpio and Amphibia Rana catesbeiana . Methods: Cross electrophoresis of agarose-starch mixed gel was used in these experiments. Results: There was no contorting phenomenon of hemoglobin in Pisces Cyprinus carpio and Amphibia Rana catesbeiana in the the course of “direct chiasma”、“crossing” and “surrounding” experimentation. Conclusion: There is no self-interaction of hemoglobin in Pisces Cyprinus carpio and Amphibia Rana catesbeiana .

　　Key words Hemoglobin;Cyprinus carpio;Rana catesbeiana;interaction

　　血红蛋白(hemoglobin，Hb)作为载氧色素家族成员之一，分布极为广泛，在生物化学、分子生物学及生物进化史上具有极其重要的地位。1991年，本研究室用交叉电泳技术证明在红细胞外，人HbA2与HbA可以发生相互作用[1](简称互作)，后来用脊椎动物门各纲动物与人Hb进行交叉电泳，发现哺乳纲、鸟纲动物Hb与人Hb明显地互作，而爬行纲有大部分物种Hb能与人Hb明显地互作，小部分物种Hb与人Hb没有互作，两栖纲、鱼纲、无腭纲动物Hb则彻底不与人Hb发生互作[2-10]。这使得我们推断羊膜类动物和非羊膜类动物Hb与人Hb的互作可能有不同的结果，Hb之间的互作可能只存在于亲缘关系较近的羊膜动物之间，各种脊椎动物与人Hb互作的不同结果的分水岭可能位于爬行纲。2001-2002年，本研究室又做了上述各纲动物Hb与人胎儿Hb的互作实验，结果发现与成人Hb的互作的结果几乎完全一致，再次证明了我们的推断[11]。为什么各种动物Hb与人Hb互作行为不同?本届研究生着重研究各种动物自身血红蛋白互作现象，以期为探讨血红蛋白互作机制提供线索。本人的实验范围是鱼纲硬骨鱼系动物鲤鱼和两栖纲动物牛蛙自身Hb的互作。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 鲤鱼(Cyprinus carpio)：鱼纲(Pisces)硬骨鱼系(Osteichthes)真骨总目(Teleostei)软鳍亚目(Malacopterygh)鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)、牛蛙(Rana catesbeiana)：两栖纲(Amphibia)弓椎亚纲(Apsidospondyli)跳行总目(Salientia)无尾目(Anura)蛙科(Ranidae)，来自包头水产品市场。

　　1.2 方法 鲤鱼、牛蛙溶血液的制备：鲤鱼和牛蛙分别采用鳃弓动脉取血法和心脏穿刺法取血，均用肝素抗凝。2 000r/min离心除去血浆,加2倍体积的生理盐水洗涤，2 000r/min离心沉淀后去上清，反复4～5次。向压积红细胞加入1～1.5体积蒸馏水及0.5～1体积四氯化碳,剧烈振荡5min后离心，取上层溶血液备用。利用本研究室自己建立并长期使用的淀粉-琼脂糖混合凝胶薄层电泳进行电泳分析。根据需要分为以下三种加样方法：(1)单排加样(非交叉电泳)：在凝胶玻璃板的一端距边缘2cm处或中央并排加样，用于比较血红蛋白电泳速度的快慢;(2)交叉电泳双排加样：前排(近阳极侧)为电泳速度相对慢的血红蛋白，后排(近阴极侧)为电泳速度相对快的血红蛋白，同时前后排各设一对照。前加样线长，后加样线短，后者成分穿过前者，我们称其为“穿过”;反之，称为“兜过”。(3)交叉电泳直接加样：在凝胶玻璃板的一端，两个较长加样线以“X”型交叉加样，称为“直接交叉”，可初步判断血红蛋白是否发生了互作。染色方法及电泳结果保存：电泳完毕，置于氨基黑10B染色液中染色2h，转入5%乙酸漂洗液中，漂洗至背景变白后取出，晾干观察结果并保存。结果判定：(1)“直接交叉”实验中原来区带出现明显扭曲现象，为有互作;原来区带未出现扭曲现象，则为无互作。(2)“穿过”实验中被穿过的区带出现明显扭曲现象且凸向阳极者为有互作，未出现扭曲现象，则为无互作。(3)“兜过”实验中兜过区带出现明显扭曲现象且凸向阴极者为有互作，未出现扭曲现象，则为无互作。

　　2 结果

　　2.1 鲤鱼Hb自身互作 鲤鱼Hb“直接交叉”电泳实验：电泳电压6V/cm，电泳时间6～7h。结果发现鲤鱼溶血液在电泳中分为三条带，分别为鲤鱼HbⅠ、Ⅱ、Ⅲ。并且电泳后未出现扭曲现象，如图1。

　　图1 鲤鱼Hb“直接交叉”电泳结果　略

　　鲤鱼Hb“兜过”、“穿过”电泳实验：电泳电压6V/cm，电泳时间6～7h。结果电泳后未出现扭曲现象，如图2、图3。鲤鱼Hb“双向”电泳实验：第一向：电泳电压6V/cm，电泳时间4～5h;第二向：电泳电压6V/cm，电泳时间6～7h。结果电泳后未出现扭曲现象，如图4。

　　图2 -　图4 略

　　2.2 牛蛙Hb自身互作 牛蛙Hb“直接交叉”电泳实验：电泳电压6V/cm，电泳时间4～5h。结果牛蛙溶血液在电泳中分为两条带，分别为牛蛙血红蛋白Ⅰ、Ⅱ。结果电泳后未出现扭曲现象，如图5。牛蛙Hb“兜过”、“穿过”电泳实验：电泳电压6V/cm，电泳时间4～5h。结果电泳后未出现扭曲现象，如图6、图7。牛蛙Hb“双向”电泳实验：第一向：电泳电压6V/cm，电泳时间3～4h;第二向：电泳电压6V/cm，电泳时间4～5h。结果电泳后未出现扭曲现象，如图8。

　　图5 -　图8 略

　　综上所述，可以看出，鲤鱼和牛蛙Hb自身在交叉电泳过程中均未出现扭曲现象。

　　3 讨论

　　本实验结果表明，鲤鱼、牛蛙Hb自身不发生互作。本文血红蛋白互作的实质是在交叉电泳过程中，不同来源的血红蛋白或血红蛋白自身之间发生的一过性对称杂交。在电场的作用下，两种不同来源的血红蛋白或血红蛋白的不同组分由于电泳速度不同而相遇(或称交叉)，形成临时结合的互作产物。互作产物的电泳速度介于原来两种血红蛋白或血红蛋白不同组分之间。但是二者的结合不牢固，不足以抵抗电场力作用而分离，恢复成原来的两种血红蛋白或血红蛋白的不同组分。这样一来，互作产物中的慢泳血红蛋白就比原来的慢泳血红蛋白快泳一段，而互作产物中的快泳血红蛋白就比原来的快泳血红蛋白慢泳一段，从而形成我们所看到的“波浪形扭曲区带”。

　　秦文斌教授对血红蛋白互作机制的解释为在血红蛋白作用过程中，两种血红蛋白在电场中分别解聚生成二聚体，并通过离子键和范德华力相互连接，组成新的杂交四聚体，作用一段时间后，在电场力的作用下分开，从而出现互作区带的扭曲现象，反之，没有形成杂交四聚体者没有互作。本文在此基础上作以下推测：(1)在血红蛋白α1β2亚基接触面上存在一个“互作结构域”，此结构域在血红蛋白互作过程起关键的作用;而在哺乳纲、鸟纲和大部分爬行纲动物有此结构域，小部分爬行纲动物、两栖纲、鱼纲和无腭纲无此结构域。(2)互作的两种不同来源的血红蛋白或血红蛋白的不同组分必须同时含有此结构域。本人的实验证明，鲤鱼和牛蛙Hb自身没有互作，可以认为他们均无此结构域。所以以往用人Hb与鲤鱼和牛蛙Hb无互作现象，可以认为是鲤鱼和牛蛙Hb无此结构域造成的。

　　参考文献

　　[1] 秦文斌.红细胞外血红蛋白A与血红蛋白A2之间的相互作用[J].生物化学杂志,1991,7(5)：583.

　　[2] 孟峻，雎天林，秦文斌.家兔血红蛋白与人正常、异常血红蛋白之间相互作用的研究[J].生物化学杂志,1997，(专刊)：37.

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　　[10] 秦良宜，秦文斌.几种哺乳动物血红蛋白与人血红蛋白A2之间的相互作用[J] .生物化学杂志，1997，(专刊)：37.

　　[11] 王步云，闫秀兰，秦文斌.两种软骨鱼血红蛋白不与人胎儿血红蛋白相互作用及其进化意义[J].包头医学院学报，2005，21(4)：326.