维生素C对硼替佐米诱导多发性骨髓瘤细胞株KM－3凋亡作用的影响

　　作者：朱云鸿， 徐瑞容 黄红铭， 丁润生， 陆 伟 作者单位：南通大学附属医院血液科， 南通 226001

　　【摘要】 目的：为了研究维生素C对硼替佐米诱导多发性骨髓瘤细胞株KM-3细胞凋亡效应的影响。方法：采用细胞计数法检测硼替佐米15 nmol/L+10、20、40、80 μmol/L维生素C处理KM-3细胞生长抑制率，用流式细胞术分析Annexin-V/PI、线粒体跨膜电位(Δψm)和氧自由基(ROS)，用分光光度法检测Caspase3活性。结果：硼替佐米对KM-3细胞增殖抑制作用降低，24 hAnnexin-V阳性细胞比例下降，△ψm降低被阻止，18 h活性氧水平下降，16 h Caspase-3活性下降。结论：维生素C对硼替佐米诱导KM-3细胞凋亡效应具有抑制作用。

　　【关键词】 多发性骨髓瘤;维生素C;硼替佐米;凋亡;活性氧

　　Effect of Vitamin C on Bortezomib-induced apoptotic death in multiple myeloma cell line KM-3

　　ZHU Yunhong，XU Ruirong，HUANG Hongming，et al (Department of Hematology， the Affiliated Hospital of Nantong University，Nantong 226001)

　　[Abstract] Objective: To investigate the effect of Vitamin C on multiple myeloma cell line KM-3 apoptosis induced by Bortezomib. Methods: Cell viability inhibition ratio was estimated by counting method. Annexin-V，mitochondrial transmembrane potential(Δψm) and reactive oxygen species(ROS) labeled by DCFHDA were examined by flow cytometry， and the activity of Caspase-3 was detected by spectrophotometry. Results: The inhibition of Bortezomib on the multiple myeloma cell line KM-3 proliferation　was decreased， the ratio of Annexin-V positive cells at the 24th hour declined， the decrease of △ψm was prevented， the level of ROS at the 18th hour dropped， and the activity of Caspase-3 at the 16th hour declined. Conclusion: Vitamin C may abrogate the ability of Bortezomib to induce apoptosis on multiple myeloma cell line KM-3.

　　[Key words] Multiple myeloma;Vitamin C;Bortezomib;Apoptosis;Reactive oxygen

　　蛋白酶体抑制剂是近年来发现的一种靶向治疗肿瘤的药物。在真核细胞中80%以上蛋白降解是通过蛋白酶体介导的，蛋白酶体抑制剂通过对蛋白酶体的抑制剂发挥抗肿瘤作用[1]。硼替佐米是一种高选择性，可逆的26S蛋白酶体抑制剂，是第1个进入临床的该类药物。目前认为硼替佐米的主要作用机制是抑制I-κB在蛋白酶体内降解，使NF-κB停留在细胞质内，功能受抑制，失去抗凋亡效应和刺激细胞增生作用[1-2]。维生素C是一种多羟基化合物有清除氧自由基，抗氧化作用[3]。研究显示维生素C能增强三氧化二砷对高发性骨髓瘤(MM)疗效[4]。本实验探讨抗氧化剂维生素C对硼替佐米诱导多发性骨髓瘤KM-3细胞株凋亡的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 细胞培养 多发性骨髓瘤细胞株KM-3(由上海长征医院血液科侯健教授惠赠)置于含10%的胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司产品)的RPMI1640培养液(Gibco公司产品)中，于37 ℃、5%CO2和95%空气湿度条件下进行培养。实验过程中，细胞以1×105细胞/ml的密度接种培养。

　　1.2 WST-1法检测生长抑制率 WST-1(碧云天生物技术研究所产品)在电子耦合剂存在的情况下，被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深;细胞毒性越大，则颜色越浅。在450 nm处有吸收峰，生长抑制率如下公式计算：

　　细胞生长抑制率(%)=(1-A实验组/A对照组)×100%

　　1.3 形态学观察 细胞收集至载玻片，用瑞氏染液染色并置于光学显微镜下观察。

　　1.4 Annexin-V分析 使用FITC标记的Annexin-V和PI双染法检测细胞凋亡，根据晶美生物工程有限公司提供的说明书进行操作。即取(5~10)万个细胞，经4 ℃ PBS漂洗2次，弃上清，加入250 μl Annexin V-FITC结合液重悬细胞。取100 μl移入流式细胞仪专用试管，加入5 μl Annexin V-FITC、10 μl碘化丙啶染色液轻轻混匀。室温(20~25 ℃)避光孵育15分钟。加入400 μl PBS轻轻混匀，用流式细胞仪进行分析。

　　1.5 线粒体跨膜电位(Δψm)检测 JC-1(碧云天生物生物技术研究所产品)在线粒体膜电位较高时聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，可以产生红色荧光;在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，可以产生绿色荧光。用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。取(10~60)万细胞，重悬于0.5 ml细胞培养液中，加入0.5 ml JC-1染色工作液，颠倒数次混匀。细胞培养箱中37 ℃孵育20分钟。600 g 4 ℃离心3~4分钟，沉淀细胞，弃上清，用冰浴的JC-1染色缓冲液洗涤2次，再用0.4 ml JC-1染色缓冲液重悬后，用流式细胞仪分析。

　　1.6 Caspase 3活性检测 Caspase 3可以催化底物Ac-DEVD-pNA产生黄色的pNA，pNA在405 nm附近有强吸收，通过测定pNA吸光度来检测Caspase 3的活性。根据碧云天生物生物技术研究所产品说明操作。600 g 4 ℃离心5分钟收集细胞， PBS洗涤1次。取200万细胞加入100 μl裂解液，冰浴裂解15分钟。4 ℃ 16 000~20 000 g离心10~15分钟，把上清转移到冰浴预冷的离心管中。取出10 μl加入反应体系37 ℃温育出现变色后，于405 nm测吸光度。对照标准曲线确定pNA量。

　　1.7 活性氧检测 DCFHDA(碧云天生物生物技术研究所产品)自由扩散进入细胞后被酯酶催化生成DCFH，DCFH不能通透细胞膜，在活性氧存在下被氧化成DCF，DCF荧光强度与细胞内活性氧水平呈正比。DCF的激发波长为488 nm，吸收波长为525 nm。收集一百万细胞悬浮于1∶5 000无血清培养液稀释的1 ml DCFH-DA中，37 ℃细胞培养箱内孵育20分钟。用PBS洗涤细胞3次，加入200 μl PBS，用流式细胞仪检测一万个细胞。

　　2 结 果

　　2.1 硼替佐米、硼替佐米+维生素C对KM-3细胞的抑制作用 KM-3细胞经10、25、50、75 nmol/L浓度的硼替佐米处理24 h后生长抑制率的3次均值分别为40.83%、44.9%、51.2%和55.17%，48 h分别为45.9%、58.7%、71.2%和78.1%。根据48 h半数抑制浓度选择药物作用浓度，因此选择硼替佐米15 nmol /L 作为药物处理浓度。再将KM-3细胞经硼替佐米15 nmol/L+维生素C 10、20、40、80 μmol/L作用24、48 h计算细胞生长抑制率3次均值分别为23.65%、11.1%、7.53%、4.3%;20.3%、9.8%、6.36%、3.40%(图1)。选择80 μmol/L作为维生素C处理浓度。

　　2.2 维生素C对硼替佐米诱导KM-3细胞凋亡作用的影响

　　2.2.1 细胞形态学改变 收集细胞涂片，瑞氏染色后光学显微镜下观察对照组和维生素C组细胞形态正常(图2A、2B)。硼替佐米+维生素C处理组细胞形态正常，偶见凋亡细胞(图2C)。硼替佐米处理组可见胞膜皱缩、染色质凝集、边缘化、胞质起泡(图2D)。

　　2.2.2 Annexin V 分析 24 hAnnexin V FITC / PI双标结果显示，硼替佐米处理组凋亡细胞比例重复3次为(16.3±1.95)%(图3A)，硼替佐米+维生素C组为(8.46±0.89)%(图3B)，低于硼替佐米处理组(P<0.01)。对照组为(5.41±1.3)%(图3C)。维生素C组为(4.9±1.4)%(图3D)。

　　2.2.3 线粒体跨膜电位变化 硼替佐米处理组24 h后△ψM检测显示△ψM降低，绿色荧光细胞比率重复3次为(11.32±1.86)%(图4A)，高于硼替佐米+维生素C处理组(5.1±0.91)%(P<0.01)(图4B)。对照组为(4.6±0.98)%(图4C)。维生素C组为3.6±0.84%(图4D)。

　　2.2.4 Caspase-3 活性 硼替佐米处理组16 h后3个平行组产生的pNA为25.21±0.349 μmol。 硼替佐米+维生素C处理组为21.79±0.198 μmol，低于硼替佐米组(P<0.01)。对照组为20.67±0.156 μmol，维生素C组为20.12±0.17 μmol。

　　2.2.5 活性氧水平变化 18 h后平均荧光强度硼替佐米+维生素C处理组为30.2±1.96(图5A)低于硼替佐米处理组为52.23±1.9(图5B)(P<0.01);对照组为28.4±1.87(图5C);维生素C组为21.3±1.6(图5D)低于对照组(P<0.01)。

　　3　讨　论

　　维生素C是具有许多生物学功能水溶性的葡萄糖类物质。Sestili等[5]认为高剂量维生素C有亲氧化作用，低剂量有抗氧化作用。维生素C既能防止化疗药物对肿瘤及正常组织的损伤[6]，又能协同化疗药物诱导肿瘤细胞的凋亡[7]。体外细胞培养实验表明，低浓度的维生素C(4 mmol/L)对SW620纤维瘤细胞有保护作用，而高剂量(>20 mmol/L)对细胞有杀伤作用[8]。

　　本实验中Annexin V/PI分析显示加入维生素C后，细胞早期凋亡率明显下降。硼替佐米处理24 h后细胞呈典型凋亡改变，加入维生素C后细胞形态大体正常。所以认为维生素C在较低浓度(80 μmol/L)下有抑制硼替佐米对KM-3凋亡的诱导作用。

　　诱导细胞凋亡有3种信号通路： 死亡受体信号通路、线粒体信号通路和内质网信号通路， 目前认为线粒体途径在凋亡过程发挥枢纽作用[9]。氧化刺激、Ca2+过量摄取等诱导因素导致的细胞凋亡，都有线粒体跨膜电位消失。因而线粒体跨膜电位的消失标志着一个不可逆转的凋亡过程。实验中发现加入维生素C后线粒体膜电位崩溃的绿色荧光细胞比率较硼替佐米处理组显著降低。

　　Caspase蛋白酶家族是引起细胞凋亡的关键酶，实验显示KM-3细胞经硼替佐米作用16 h后pNA产生增加Caspase-3活性较对照升高，加入维生素C后pNA产生减少，酶活性下降。

　　正常情况下NF-κB是一种核转录因子，在细胞质中与抑制剂I-κB相互作用形成复合体，防止NF-κB进入核内，NF-κB介导的转录作用被阻断;一旦I-κB磷酸化与NF-κB解离，NF-κB进入核内诱导抗凋亡蛋白的合成，细胞增生并表达黏附分子导致细胞增生、存活;而在MM瘤细胞中NF-κB组成性激活，导致瘤细胞不断增生。如果I-κB在蛋白酶体内降解受抑制，NF-κB停留在细胞质内，功能受抑制，失去抗凋亡效应和刺激细胞增生作用[10-11]。目前认为这是硼替佐米的主要作用机制，但硼替佐米并不仅仅通过抑制该通路发挥作用，还存在其他作用机制。

　　活性氧是细胞凋亡的信号之一，活性氧的产生可直接或间接改变线粒体膜电位，促进CytC从线粒体内释放，启动线粒体信号通路[12]。陈丽娟等[13]研究发现硼替佐米可改变多发性骨髓瘤U266细胞株内氧化还原状态，导致线粒体和内质网产生活性氧增多，从而诱导U266细胞凋亡。由此推测，线粒体途径参与了硼替佐米诱导的多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡。

　　实验中用DCFHDA作为荧光探针测定细胞内活性氧水平时，发现维生素C降低了硼替佐米产生的活性氧水平，降低了无诱导因素作用的对照组细胞活性氧水平。因而认为维生素C能清除胞内活性氧，正是该作用降低硼替佐米诱发的活性氧水平，阻止了线粒体膜电位的崩溃。

　　本实验探讨了维生素C在体外环境、低浓度下对硼替佐米作用影响，至于高浓度及体内条件下的作用需进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1] Hideshima T，Chauhan D，Richardson P，et al.NF-kappa B as a therapeutic target in multiple myeloma[J]. J Biol Chem， 2002，277(19):16639-16647.

　　[2] Hideshima T，Mitsiades C，Akiyama M，et al.Molecular