进展型脑梗死患者凝血抗凝血指标和血小板活化蛋白的检测及临床意义

　　作者：曾钦凤，钟毓琼，梁淑连，易伟连 作者单位：1.广东医学院第二附属医院检验科，广东湛江 524003;2.广东医学院附属医院检验科，广东湛江 524001

　　【摘要】 目的 探讨进展型脑梗死患者凝血抗凝系统以及血小板活化蛋白的表达变化及其临床意义。方法 利用流式细胞仪、ACL9000全自动血凝分析仪对90例急性脑梗死患者(42例进展型脑梗死和48例完全脑梗死)治疗前同时进行血小板计数(PLT)，血小板平均体积(MPV)，纤维蛋白原(Fg)、血小板膜糖蛋白(CD62p、CD63、PAC1)检测，ELISA定量分析血管血友病因子(vWF)。其结果与本院体检健康者45例进行对比。结果 脑梗死患者各项指标与正常对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。除MPV外，进展型脑梗死患者与完全型脑梗死各项指标均差异有统计学意义。结论 进展型脑梗死患者存在着明显的高凝血状态，应尽早采用抗凝治疗以及应用血小板活化抑制剂。

　　【关键词】 脑梗死;血液凝固;抗凝系统;血小板膜糖蛋白

　　进展型脑梗死为发病后48h内神经功能缺损症状呈逐步或阶梯式进展的过程[1]，与脑梗死本身一系列级联性病理生理变化有关，但其确切的病理生理机制尚不明了。进展型脑梗死的病死率、致残率高，预后差，缺乏针对性的特效治疗，已成为医疗界一大难题。本文检测了42例进展型脑梗死患者的凝血抗凝系统和血小板活化指标，旨在为其临床的诊断和治疗提供一定的依据。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象

　　选择2006年1月至2008年3月在本院住院诊治的急性脑梗死患者90例，分为进展型脑梗死和完全型脑梗死两组，进展型患者42例，符合欧洲进展型缺血性卒中评分者为进展型脑梗死组(Ⅰ组)，男24例，女18例，年龄51～88岁，平均(62.7±10.8)岁。完全型脑梗死组(Ⅱ组)48例，男26例，女22例，年龄49～82岁，平均(59.8±7.9)岁，均符合全国第4届脑血管疾病学术会议通过的脑梗死诊断标准，并经头颅CT或MRI证实;排除脑水肿，出血、占位和房颤、严重感染以及肝肾功能不全者。健康对照组(Ⅲ组)为本院体检健康者45例，男25例，女20例，年龄52～70岁，平均(60.5±5.83)岁，无心脑血管疾病的健康体检者。3个组的年龄、性别等差异无统计学意义。

　　1.2 方法

　　1.2.1 仪器和试剂 鼠抗人CD62pFITC(异硫氰酸荧光素)，CD63FITC荧光单克隆抗体及鼠IgG1PE荧光抗体，购自BeckmanCouletr公司。PAC1FITC荧光单抗及鼠IgMFITC购自美国BD公司。流式细胞仪为美国Coulter公司EPICLXL型。PT、APTT、TT、Fg用ACL9000全自动血凝分析仪测定，试剂由美国Instrumentation Laboratory公司提供。vWF用ELISA酶联免疫酶标比色仪定量分析，试剂由上海太阳公司提供。

　　1.2.2 检测方法 均于清晨空腹抽取静脉血，枸橼酸钠抗凝血以2500×g离心15 min后收集乏血小板血浆，即刻测定PT、APTT、TT、Fg。EDTAK2抗凝血以500 r/min离心5 min，吸取200 μL富含血小板的血浆至1mL TEN缓冲液中，混匀后吸取200 μL到200 μL的2%多聚甲醛固定20 min，分别吸取50 μL血小板悬液和10 μL的CD62pFITC，CD63FITC，PAC1FITC荧光单抗及各自阴性对照IgG1FITC，IgMFITC,在室温避光放置15 min，加1 mL TEN缓冲液上FCM测定。测定前用FlowCheck液进行光路流路标定，将CV值调整在2%以内，细胞根据前向散射光和侧向散射光设门血小板调阴性对照管，调整非特异性结合在1%左右。每测定管收集10000个以上细胞记录CD62p、CD63、PAC1的表达率。

　　1.3 统计学处理

　　所有数据用SPSS13.0软件处理，数据均以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析及q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　脑梗死患者各项指标均与健康对照组比较差异有统计学意义(P<0.05或0.01)。除MPV外，进展型脑梗死患者与完全型脑梗死患者各项指标均差异均有统计学意义(P<0.05或0.01)，详见表1、2、3。

　　2.1 三组凝血指标的变化(表1)表1 三组凝血指标检测结果比较 组间两两比较均P<0.01。

　　2.2 三组抗凝系统和vWF的变化(表2)表2 三组抗凝系统指标和vWF检测结果比较 注：与Ⅲ组比较*P<0.05，**P<0.01;Ⅰ组与Ⅱ组比较▲P<0.05。

　　2.3 三组血小板膜糖蛋白CD62p、CD63、PAC1和相关参数的变化(表3)表3 血小板膜糖蛋白CD62p、CD63、PAC1和相关参数检测与Ⅲ组比较：*P<0.05、▲P>0.05，余两两比较均P<0.01。

　　3 讨论

　　第6期 曾钦凤，等.进展型脑梗死患者凝血抗凝血指标和血小板活化蛋白的检测及临床意义在正常生理情况下，机体凝血抗凝和纤溶抗纤溶机制互相平衡，保证了血液在体内正常流动。PT、APTT、TT和Fg可反映机体内源性和外源性凝血系统各凝血因子的综合情况，是机体内血液凝血功能重要参考指标。研究表明凝血抗凝失衡是急性脑梗死的重要危险因素[2]。本研究结果表明进展型脑梗死组的PT、APTT、TT较完全型脑梗死组和健康对照组显著缩短，Fg水平显著升高(P<0.01)，说明进展型脑梗死患者较完全型患者具有更高的高凝血状态。AT、PC、PS是体内三大抗凝因子，通过灭活凝血辅助因子，阻碍因子Ⅹa与血小板结合，促进纤溶而起抗凝血、促进纤维蛋白溶解作用。本文结果表明进展型脑梗死组AT、PC、PS活性较完全型脑梗死组和健康对照组低，差异有统计学意义，同时vWF亦明显升高。vWF由血管内皮细胞合成和分泌的多聚体，作为一种黏附蛋白能介导血小板与血管基底膜的结合。研究表明vWF只在血管内皮受损部位受凝血酶的刺激后由内皮细胞释放，在血管中短暂存在。vWF明显升高提示血管内皮细胞有损伤[3]，可能是由于脑动脉炎导致血管内皮细胞受损，使vWF释放增加的缘故。内皮细胞损伤的同时，PC被活化，在灭活Ⅷa等凝血因子及诱发纤溶过程中抗凝物质被消耗。由于PS为PC的辅助因子，故PS随之也被消耗，使进展型脑梗死患者血液处于更加高凝的状态。

　　血小板的质与量的变化在脑梗死发病机制中起重要作用。正常人的血小板基本处于静息状态，而在生理和病理性的血栓前状态、血栓性疾病过程中，血小板发生活化反应，激活的血小板可释放出多种活性物质以及表达多种分子标志物，促进血管内血栓的形成。本研究结果表明脑梗死患者PLT明显低于健康对照组，提示可能是血小板参与黏附、聚集和血栓形成、大量消耗了血小板，导致了血小板数量的减少。同时，进展型脑梗死组血小板比完全型脑梗死组降低更加明显，可能是由于进展型脑梗死患者病情持续加重，血栓的反复形成而致消耗更多的血小板。同时进展型脑梗死组和完全型脑梗死组MPV均较健康对照组明显升高，但进展型脑梗死组和完全型脑梗死组之间无明显差别。外周血中PLT减少，反馈性引起骨髓巨核细胞增多，产生较多的新生PLT。新生PLT体积较大，含有较多的α颗粒，能释放更多的5羟色胺等活性物质，血小板更易于聚集和黏附[4]，使得血栓形成的速度加快，梗死面积增多。

　　血小白膜糖蛋白是血小板膜上的一组蛋白受体，参与介导血小板的黏附和聚集反应，是衡量血小板活化的理想指标。血小板膜糖蛋白特别是CD62p、 CD63 、PAC1的测定较为灵敏，能特异的反映血栓疾病的发生发展。CD62p通过血小板P选择素介导血小板黏附于内皮细胞及血小板与中性粒细胞和单核细胞的连接，从而促使中性粒细胞激活，血管活性物质、氧代谢产物释放等多种生物学效应，启动血栓形成过程。CD63为溶酶体完整膜糖蛋白，在活化血小板膜和表面连接的血管系统膜上大量表达,作为活化分子，其可介导活化血小板，内皮细胞与中性粒细胞结合后，参与早期炎症反应、血栓形成及肿瘤转移等病理过程[5]。PAC1的存在是血小板聚集的必要条件。正常情况下，虽然90%PAC1以复合物的形式存在，但没有与配基结合的能力。血小板活化后，其形态结构和空间构象及周围微环境发生改变，PAC1的配基结合位点暴露，产生受体活性，与多种黏附蛋白结合，完成黏附、伸展、释放和聚集过程。本研究结果显示，进展型脑梗死组和完全型脑梗死组血小板糖蛋白CD62p、CD63、PAC1阳性表达率明显高于健康对照组，且进展型脑梗死组CD62p、CD63、PAC1明显高于完全型脑梗死组，提示血小板活化是脑梗死发病急性期的重要病理基础之一，而且随着血小板活化程度的增强，血栓进展的严重程度明显增强，脑梗死病情越重，临床上可认为CD62p、CD63、PAC1作为脑梗死疾病发生发展的敏感指标。

　　总之、血凝异常以及血小板高度活化是进展型脑梗死的相关危险因素。通过对凝血抗凝系统的监测以及血小板活化指标的监测，表明对进展型脑梗死患者应尽早采用抗凝治疗以及应用血小板活化抑制剂，以获得最佳治疗效果，改善预后、降低病死率。

　　【参考文献】

　　[1] 王维治.经病学 [M]. 北京:人民卫生出版社, 2006:737740.

　　[2] 谭红愉,李少明.血浆D二聚体改变与急性脑梗死预后的关系[J].广州医学院学报,2003,31(2):7778.

　　[3] Budde U, Schneppenheim R. Von Willebrand factor and von Willebrand disease[J]. Rev Clin Exp Hematol, 2001, 5(4):335368.

　　[4] Jurk K, Jahn U R, Van A H, et al. Platelets in patients with acute ischemic stroke are exhausted and refractory to thrombin, due to cheavage of the seventransMembrane thrombin reeptoy(PAR1)[J]. ThrombHaemost, 2004, 91(2):334344.

　　[5]施寅铨,潘伟民.冠心病患者血小板糖蛋白CD62p达和血黏度的临床研究[J].临床中老年保健, 2003, 3(1):11.