FLT3基因动态监测在急性髓系白血病治疗中的应用

作者：李树，王彤，王杰，李军，张璐   

作者单位：中国刑警学院法医教研室，沈阳 110035

 【摘要】  微小残留病(Minute Residual Disease, MRD)是急性髓系白血病(Acute myeloid leukaemia, AML)复发和妨碍长期无病生存率的重要原因。本研究旨在探讨FLT3基因在AML发病中的作用及对微小残留病(MRD)检测的意义。 应用PCR技术检测了125例AML患者在化疗与异基因造血干细胞移植（alloHSCT）治疗前后FLT3基因的表达，并对FLT3基因阳性者进行了随访观察。结果表明： PCR检测FLT3基因的灵敏度为10-4；AML初诊患者中FLT3基因的阳性表达率为69.6%；完全缓解(CR)患者FLT3表达基因阳性表达率44.90%，FLT3转为阴性者占48.98%；FLT3表达无改变者占6.12%；复发者FLT3基因表达转为阳性，而未缓解者FLT3持续阳性，治疗前FLT3阳性AML患者完全缓解率低于FLT3基因表达阴性患者，两者有显著性差异(p<0.05)。获得CR的FLT3阳性AML患者的复发率显著高于FLT3阴性患者(p<0.05)。结论：　FLT3基因表达与白血病发生有关，PCR动态检测AML患者治疗前后FLT3表达水平,可作为判断AML白血病预后和监测微量残留病的一项指标。

【关键词】  急性髓系白血病

    Dynamic Detection of FLT3 Gene in Patients with AML and Its Significance

    LI Shu, WANG Tong1, WANG Jie1, LI Jun, ZHANG Lu

    Department of Forensic Medicine, China Criminal Police University, Shenyang 110035, China; 1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Shenyang Medical College, Shenyang 110034, China

    Abstract    Minimal residual disease (MRD) is an important cause of  relapse and  diseasefree survival  time decrease in patients with acute myeloid  leukemia (AML). This  study was aimed to  explore the role of  FLT3 gene in AML pathogenesis and its significanse for detection of MRD. Using genomic PCR, 125 AML patients were detected for FLT3 gene expression before and after chemical therapy and allogeneic  hematopoietic stem cell transplantation (alloHSCT), meantime the AML patients with   FLT3 positive expression  were observed by followup. The results showed that  the sensitivity  of PCR was 10-4 in FLT3 gene detection; the rates of FLT3 positive expression were 69.6% and 44.90% in the newly diagnosed   AML patients  and complete remission (CR) patients respectively. The rate of FLT3 expression coverted to negative was  48.98% in treated AML patients,  while  no change of FLT 3 expression was found in  6.12% treated patients. The  FLT3 expression converted to positive in relapsed patients, and FLT3 expression remains positive in nonremitted patients. The CR rate in FLT3 positive expression patients before treatment was significantly lower than that in  FLT3 negative expression patients, the difference of which was statistically significant (p<0.05). The  AML relapse rate in FLT3 positive  patients was significantly higher than that in FLT3 negative expression patients (p<0.05). It is concluded that  FLT3 gene expression is related to leukemia pathogenesis;  the dynamic levels of FLT3 expression before and after treatment can be  used for estimating  prognosis of AML patients and  detecting   MRD.

Key words    AML; FLT3 gene; MRD; leukemia  prognosis; PCR

    J Exp Hematol 2007; 15(4):705-708

    急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML)是发病率最高的一种造血系统恶性肿瘤，化疗方法的完善和造血干细胞移植技术的开展使AML的预后有了很大改善，但仍有不少患者复发。目前认为，微小残留病（MRD）是白血病治疗缓解后复发的最重要的原因［1］。近年来分子生物学技术的发展，为常规骨髓形态学检查难以检测的MRD提供了新方法，然而目前尚缺乏合适的MDR的检测指标。FLT3是与AML发生及预后相关的一种重要因子［2］。因此，我们把FLT3作为MRD的基因标志，应用PCR技术监测AML的治疗过程，并探讨其临床意义。

    材料和方法

    标本来源

    中国实验血液学杂志  J Exp Hematol 2007; 15(4)FLT3基因动态监测在急性髓系白血病治疗中的应用标本来自1998年3月至2005年10月中国医科大学和沈阳医学院附属医院血液科门诊及住院治疗的125例AML患者。所有患者均经形态学及骨髓活检确诊。125例AML患者中男72例，女53例，平均年龄13岁(3个月-61岁)，按FAB分型为M0 7例、M1 9例、M2 31例、M3 8例、M4 18例、M5 26例、M6/7 10例和M7 16例。对初诊时具有FLT3基因表达阳性的87例患者分别在初诊、完全缓解及缓解后3个月、6个月各取骨髓或外周血标本1次，以进行FLT3基因动态检测。对照组为同期就诊的非白血病(淋巴瘤、过敏性紫癜、免疫性血小板减少性紫癜）患者及健康供者，男、女各10名，平均年龄18(9-57)岁。

    治疗方案及疗效标准

    采用标准的DA (柔红霉素+阿糖胞苷) 、HA (高三尖杉酯碱+阿糖胞苷)方案诱导缓解，难治、复发患者则采用米托蒽醌或去甲氧柔红霉素或安吖啶+阿糖胞苷诱导缓解，对于随后相继以原方案及中等剂量阿糖胞苷巩固强化治疗。对于M3患者则采用全反式维甲酸诱导分化达完全缓解后，给予AML方案巩固强化治疗。62例患者在完全缓解后行亲缘或非亲缘供者alloBMT。疗效判断标准按照张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》［3］。

    基因组DNA的提取

    对患者骨髓或健康志愿者外周血标本采用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用传统酚/氯仿/异丙醇法抽提DNA。核酸蛋白测定仪测定吸光度值为2.37-2.69，调整DNA浓度为200 ng/μl。 -70℃保存备用。

    PCR引物及PCR扩增产物

    针对FLT3基因内部重复串联结构主要发生在11号外显子［4］，在11号外显子近端和远端分别设计引物11F和11R，扩增产物为大小133 bp 。同时设计对照组βactin引物actin F和actin R，扩增产物为305 bp。以上引物均由宝生物制品公司合成，引物序列为：

    11F：  5'CAATTTAGGTATGAAAGCC3'；

    11R：  5'CAAACTCTAAATTTTCTCT3' ；

    actin F：5'CTTCTACAATGAGCTGCGTG3'；

    actin R：5'TCATGAGGTAGTCAGTCAGG3'

    PCR反应体系50 μl , 包括上、下游引物各0.2 μmol/L, dNTPs 0.25 mmol/L, Taq DNA 聚合酶2.5 U, 模板DNA 200 ng。反应条件为94℃变性3分钟后，94℃  1分钟, 60℃ 1分钟, 72℃ 1分钟，35个循环，最后72℃延伸10分钟。取PCR 产物13 μl，加溴化乙锭2 μl，于2%琼脂糖凝胶上电泳20分钟， pBR322 (Hind Ⅲ)作为标志物，用紫外投射仪分析图像并照相。用QIA quick Gel Extraction试剂盒(Qiagen公司产品)回收纯化PCR产物，由中国刑警学院法医系测序。所得序列资料在线使用Blast进行同源性比对分析。

统计学分析

    患者全部资料包括返院复查或信访资料输入计算机用SPSS 11.5统计软件生命表法进行统计。

    结    果

    PCR检测FLT3基因的灵敏性

    取FLT3基因表达阳性的AML患者的样本1 μg，按1∶10连续稀释DNA，然后行PCR扩增，确定本实验扩增FLT3的灵敏度为10-5以上(总DNA  1 μg时设为1)，即100 pg (结果未显示)。

    FLT3基因在AML初诊患者中的表达

    FLT3基因经PCR扩增后电泳，在133 bp位置出现特异性扩增带。结果显示，125例患者中87例呈FLT3基因表达阳性，占69.6%（表1）。 DNA测序及Blast比对分析结果证实， 在FLT3阳性标本均未见重复序列、点突变及插入（结果未显示）。

    AML治疗后FLT3基因表达情况

    治疗前FLT3基因表达阳性的87例AML患者，经DA或HA标准化疗1-2个疗程或维甲酸诱导(M4)治疗2个月后，49例达完全缓解（CR），其中22例FLT3表达减弱，占44.90%；24例FLT3转为阴性，占48.98%；3例无改变，占6.12%。随访3-18个月，16例复发者FLT3基因表达转为阳性，2例在临床复发前1-2个月FLT3已呈阳性表达。38例未获缓解者，FLT3持续阳性。而38例治疗前FLT3阴性患者，经同样方案治疗后33例达到CR；随访3-18个月后2例复发，FLT3基因表达转为阳性。此结果表明FLT3与AML发病及疾病状态有关，同时也反映出FLT3基因表达与MRD有关。

    FLT3基因表达与预后的关系

    治疗前FLT3基因表达阳性的87例AML患者经2个月治疗，49例达CR，完全缓解(CR)率为56.32%，低于FLT3基因表达阴性组的86.84%(33/38)，统计学分析显示两者有显著性差异(p<0.05)。49例获CR的FLT3基因表达阳性AML患者在缓解期有25例仍可检测出FLT3基因，此25例虽经正规定期强化治疗及亲缘或非亲缘供者alloBMT，但均于1年内复发，复发时间平均6.5个月(2-11个月)，复发率为58.93%。而24例获CR的FLT3基因表达阴性AML患者，在CR后1年内复发率为25.0% (6/24)，FLT3基因表达阳性AML患者CR后1年内复发率显著高于FLT3基因表达阴性患者(p<0.05)（表2）。

    讨    论

    人FLT3基因定位于染色体13q12，是Ⅲ型酪氨酸激酶受体(RTKm)成员之一。FLT3与配体结合后，发生同源二聚化，使激酶区接近酪氨酸残基自主磷酸化，引起Ras和STAT5信号转导途径激活，从而转导细胞分裂信号。正常情况下，FLT3基因存在于早期造血组织，与造血细胞的生长、增殖、凋亡有关［5］。FLT3基因发生突变，可破坏正常血细胞的增殖分化与凋亡，是AML中突变率最高且与预后相关的重要因子［6］。本研究采用PCR技术检测了125例AML患者中FLT3基因表达情况，发现阳性率69.6%，与文献报道一致［56］，提示FLT3基因在大多数AML中表达阳性。目前化疗及造血干细胞移植是治疗AML的主要方法，MRD是治疗后复发的主要原因之一，测定MRD是指导缓解后治疗及判断预后的关键。本研究结果显示，在大多数AML患者中FLT3基因表达阳性，因此FLT3可作为检测AML残留白血病的一个重要标志。

    随着急性白血病化疗方案的改善和造血干细胞移植的进展，急性白血病的完全缓解(CR)率明显提高。然而仍有许多CR患者在数年内复发，其主要原因是血液学CR后体内仍残留106-109白血病细胞，称为微小残留病(MRD)。现在普遍认为MRD是血液学CR乃至持续完全缓解(CCR)期间白血病复发的根源［7］。目前检测MRD 的方法主要有3种：荧光原位杂交、PCR 和流式细胞术，其中以PCR 法最敏感，临床应用最广。据文献报道灵敏度可高达106-107水平，比染色体技术更加灵敏［8］。在本实验中我们利用PCR技术探索了FLT3基因的最低检出值，结果显示样本中提取的DNA稀释至100 pg时仍可以检测到FLT3基因表达，说明PCR方法可以检出白血病患者FLT3基因，用于AML患者CR后MRD的检测。

我们用FLT3基因作为AML的分子标志，通过PCR技术跟踪了AML完全缓解后的MRD，结果表明： ①治疗前FLT3阳性AML患者，经标准治疗后，低于半数的患者达到完全缓解（CR），其中绝大部分患者FLT3基因表达减弱或转为阴性；随访3-18个月，复发者FLT3基因表达转为阳性，此结果表明FLT3基因表达与AML发病及疾病状态有关，同时也反映出FLT3基因表达与MRD有关。②FLT3基因表达阳性AML患者治疗后，完全缓解(CR)率低于FLT3基因表达阴性的患者；另外FLT3基因表达阳性AML患者在缓解期仍可检测出FLT3基因，且均于1年内复发，复发率显著高于FLT3基因表达阴性患者,表明FLT3基因表达与预后有关。③AML患者达CR后均需要巩固强化治疗,以消除MRD。④AML患者达CR后FLT3基因表达持续阳性或转阴后再次出现阳性，提示将发生复发，此结果表明FLT3基因能提前预示AML复发。 FLT3转为阴性或长期持续阴性者预示能获得长期无病生存。

    所以,在完全缓解期追踪检测FLT3基因并分析其变化极为重要, 该基因持续阳性或由阴性变为阳性,其复发的危险度是明显增高的,这对及时调整化疗方案、预防复发有着重要的临床意义。

【参考文献】  1Kerst G, Kreyenberg H, Roth C, et al. Concurrent detection of mi nimal residual disease (MRD) in childhood acute lymphoblastic leukaemia by flow cytometry and real time PCR. Br J Haematol, 2005; 128:774-782

2 汪亚伦, 王彤, 许凤等. 急性髓系白血病细胞Flt3表达及Flt3/ITD突变分析. 中国实验血液学杂志, 2006; 14:456-459

3张之南. 血液病诊断及疗效标准. 第2版. 北京:科学出版社. 1998: 171-182

4Xu F, Taki T, Eguchi M, et al. Tandem duplication of the FLT3 gene is infrequent in infant acute leukemia. Leukemia, 2000; 14:945-947

5Stirewalt DL, Radich JP. The role of FLT3 in haematopoietic malignancies. Nat Rev Cancer, 2003; 3:650-665

6Birg F, Courcoul M, Rosnet O, et al. Expression of the FMS/KITlike gene FLT3 in human acute leukemias of the myeloid and lymphoid lineages. Blood, 1992; 80: 2584-2593

7Potter MN, Cross NC, vanDongen JJ, et al. Molecular evidence of minimal residual disease after treatment for leukaemia and lymphoma: an updated meeting report and review. Leukemia, 1993; 7:1302-1314

8 Yokota H, Kitamura K. The genetic diagnosis of hematopoietic malignancy by polymerase chain reaction method. Rinsho Byori, 2000; 48:708-715