组织因子表达影响阿霉素诱导人神经母细胞瘤凋亡的研究

　　作者：夏凌辉 周木想 作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院血液科，武汉 430022

　　关键字:组织因子表达影响阿霉素诱导人神经母细胞瘤凋亡的研究

　　Regulation of Tissue Factor on Doxorubicininduced Apoptosis in Human Neuriblastoma

　　FANG Jun1,2*,TANG Hao3,XIA Linghui,ZHOU Muxiang4,LEI Ting3,WEI Wenning,HU Yu1,2,SONG Shangjun1

　　(1.Department of Hematology,Affiliated Union Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan,430022,China;2.Molecular Targeting Laboratory of Hubei Province;3.Department of Neurosurgery,Affiliated Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology;4.Division of Hematology/Oncology,Department of Pediatrics,Emory University School of Medicine,Atlanta,USA)Abstract: Objective To investigate the regulation of tissue factor(TF) on chemotherapeutic reagentinduced apoptosis in human neuroblastoma.Methods The expression of TF was examined by Western blotting.TFpcDNA 3 expression vector was transfected by using lipofectamine 2000.The cytotoxicity of doxorubicin was determined by WST assay.The activation of Caspase3 and PARP induced by doxorubicin were tested by Western blotting.Apoptotic cells were stained by Hochest 33342 and counted under fluorescence inverted microscope.Results Human neuroblastoma cell line SHEP1 expressed high level of TF while SKNSH was with lowTF level.TFpcDNA 3 plasmid was transfected to SKNSH cells and expression of TF significantly increased.Enforced expression of TF decreased the cytotoxicity of doxorubicin in transfected SKNSH cells.Cleavage of Caspase3 and PARP,which are the main effectors of doxorubicininduced apoptosis,also impaired in transfected SKNSH cells with upregulation of TF.TF expression also decreased the apoptotic cell number in TFenforced expressing SKNSH cells(134.33±21.00) contrasted to those control cells transfected with pcDAN 3(232.33±8.84,P<0.05)while exposing to 1 μg/ml doxorubicin for 24 h.Conclusion These results suggest that aberrant expression of TF could inhibit doxorubicininduced apoptosis in human neuroblastoma cells.Overexpression of TF might contribute to chemotherapy resistance in neuroblastoma and its progression,at lest in part,by regulating doxorubicininduced apoptosis.Key words: Tissue factor; Neuroblastoma; Apoptosis; Chemotherapy

　　组织因子(tissue factor,TF)是外源性凝血途径的启动因子，内皮细胞和单核细胞TF表达及活性的增强与血栓栓塞性疾病密切相关。然而，TF在多种肿瘤如乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、神经母细胞瘤等表达异常增高，其表达水平与肿瘤分化程度等病理特征相关，与预后呈负相关[1,2]。近年来研究发现TF具有信号转导受体的功能，可通过诱导多种信号转导增强肿瘤的生长、侵袭及转移[3]。TF影响肿瘤发生发展的机制目前并未完全阐明。TF是否参与化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡，影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性尚无报道。本文通过基因转染研究了TF在人神经母细胞瘤中的高表达对阿霉素诱导肿瘤凋亡的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞系与试剂 人神经母细胞瘤细胞系SKNSH及SHEP1由美国Muxiang Zhou教授惠赠(Emory University,Atlanta,USA)，在含10%胎牛血清、2 mMLglutamine,50 u/ml青霉素及50 μg/ml链霉素的RPMI 1640中，37℃、5%CO2环境下培养。鼠抗人TF单抗(TF910H10)购自Calbiochem(San Diego,CA),鼠抗人caspase3及βactin单抗购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA),鼠抗人PARP单抗购自BD Biosciences(San Jose,CA)。

　　1.2 质粒及基因转染 采用作者既往构建的含有TF全长cDNA的真核表达载体TFpcDNA 3[4]。SKNSH细胞以1×106/孔密度接种于6孔培养板，24 h后以Lipofectamine 2000TM(Invitrogen,CA,USA)介质进行瞬间转染，每孔转入质粒2 μg;以空载体pcDNA 3作为对照，48 h后收获细胞用于检测蛋白表达或阿霉素诱导凋亡相关实验。

　　1.3 Western印迹法 收集细胞后，以细胞裂解液处理，离心后取上清，以考马斯亮蓝法(Protein assay,BioRad,美国)进行蛋白质定量。蛋白变性后，以含有10 μg总质白的样本进行10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，之后将凝胶上的蛋白质电转移到硝酸纤维素膜上，封闭液封闭后，分别以特异性TF、Caspase3、PARP或βactin单抗孵育，4℃过夜，继而与辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，以增强化学发光法(ECL,Amersham Life Science,英国)显色。以βactin作为蛋白质完整性及等量的对照。

　　1.4 细胞毒性试验(WST法) 阿霉素对人神经母细胞瘤细胞系的细胞毒性以WST(watersoluble tetrazolium salt)法检测，原理与MTT法相同，以水溶性四唑盐WST1(Roche,德国)替代MTT,WST1被具有代谢活性的细胞中的线粒体相关脱氢酶裂解，产生的有色产物可直接在分光光度计上检测，其浓度与细胞活性成正比，而不需加入二甲亚砜溶解MTT法产生的难溶性的蓝色结晶物，因此操作更简便，结果更稳定[5]。将胶质瘤细胞以5×104/孔密度接种于96孔培养板，与不同浓度的阿霉素孵育44 h，之后每孔加入WST1试剂25 μg，37℃继续孵育4 h后，450 nm波长测定光密度(optical density,OD)，参考波长为620 nm。

　　1.5 细胞凋亡检测 经过处理的细胞以10 μM Hoechst 33342(invitrogen,CA)于37℃染色1 h，而后在倒置荧光显微镜(Olympus IX50)下观察。由不了解本研究的观察者计数凋亡细胞数，共完成3次独立实验，每个实验中每次处理条件下从3个培养孔中随机选择视野(200×)计数。

　　1.6 统计学处理 上述实验中每种处理均重复进行3次，部分结果以均数±标准差表示。选用t检验法进行统计学处理，以P<0.05作为有统计学显著性差异

　　2 结 果

　　2.1 TF在人神经母细胞瘤细胞系SHEP 1及SKNSH中的表达水平 人神经母细胞瘤细胞系SHEP 1和SKNSH的TF表达水平以Western印迹法检测，可见SKNSH细胞中存在TF表达，但水平低下，而SHEP 1细胞中TF呈强表达(图1)。

　　2.2 TFpcDNA3表达载体在人神经母细胞瘤细胞中的转染及表达 本研究采用既往构建的TFpcDNA 3表达载体，以脂质体Lipofectamine2000介导转染SKNSH细胞48 h后，TF表达水平显著增高，转染质粒总量为2 μg/孔(图2)。

　　2.3 TF表达增强抑制阿霉素对SKNSH的细胞毒性 以TFpcDNA 3表达载体或对照pcDNA 3质粒分别转染SKNSH细胞，而后以不同浓度的阿霉素处理48 h，以WST法检测阿霉素的细胞毒性，结果显示转染TFpcDNA 3的SKNSH细胞与对照相比，存活细胞数显著增多，提示在TF表达增强的SKNSH细胞中，阿霉素的细胞毒性减弱(图3)。

　　2.4 TFpcDNA 3减弱阿霉素在SKNSH细胞中诱导的Caspase3及PARP活化 以TFpcDNA 3表达载体或对照pcDNA 3质粒分别转染SKNSH细胞，而后以1 μg/ml阿霉素处理4 h、8 h、24 h，Western印迹法结果显示，转染TFpcDNA 3的SKNSH细胞中，阿霉素诱导的Caspase3及PARP的裂解均较对照减弱(图4)。

　　2.5 TFpcDNA 3抑制阿霉素诱导的SKNSH细胞凋亡 以TFpcDNA 3表达载体或对照pcDNA 3质粒分别转染SKNSH细胞，而后以1 μg/ml的阿霉素处理24 h，经Hochest 33342染色，荧光显微镜下观察凋亡细胞数，结果显示转染TFpcDNA 3的SKNSH细胞凋亡数为134.33±21.00，对照细胞凋亡数为232.33±8.84(P<0.05)，提示TF表达上调的SKNSH细胞经阿霉素处理后，凋亡较对照细胞显著减少(图5)。

　　3 讨 论

　　组织因子(tissue factor,TF)是凝血途径的启动因子。近年来发现，TF不只是重要的凝血因子，还在肿瘤生长、侵袭和转移、血管新生、炎症、胚胎发育等多种病理生理过程中发挥调控作用[2,3,6]。TF促进肿瘤生长、侵袭和转移的非凝血功能与新近确认的TF信号转导受体特性密切相关[2]。TF作为跨膜糖蛋白，与其配体凝血因子Ⅶ(coagulation factor Ⅶ,FⅦ)或活化因子Ⅶ(activated FⅦ,FⅦ)结合，所形成的复合物可以诱导多种信号转导。TF增强肿瘤生长、侵袭及转移的机制较为复杂，现有研究认为与其增强肿瘤局部纤溶活性，影响细胞骨架系统，促进肿瘤血管新生等有关[7]。但是TF高表达影响肿瘤发生发展的机制并未完全得到阐释。凋亡是肿瘤发生的关键，抗肿瘤治疗化疗或放也主要是通过诱导凋亡杀伤肿瘤细胞，化疗药物如不能诱导肿瘤凋亡则可能导致抗肿瘤治疗的耐受或抵抗[8，9]。如前所述，TF表达水平与多种肿瘤的组织学分级及预后相关，TF表达水平高的肿瘤分化程度低、预后差。TF的异常表达是否干预肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，参与调控化疗药物诱导的肿瘤凋亡，籍此影响预后并未阐明。国外研究报道TF/FⅦ复合物能通过激活PI3K/Akt信号转导抑制去血清诱导的幼仓鼠肾细胞(BHKTF)凋亡，提供了TF参与凋亡调控的初步线索[10,11]。但TF表达在肿瘤凋亡中的作用并未阐明。本文以TFpcDNA 3表达载体在SKNSH细胞中显著上调TF表达，发现阿霉素对人神经母细胞瘤的细胞毒性随之减弱，提示TF基因上调可能抑制化疗药物对神经母细胞瘤细胞的杀伤作用。诱导凋亡是许多化疗药物杀伤肿瘤细胞的机制之一。Caspase3及聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶(PARP)是阿霉素诱导凋亡的主要效应分子[12]。因此为了研究TF影响阿霉素对人神经母细胞瘤细胞毒性的机制，我们以TFpcDNA 3转染低表达TF的SKNSH细胞，随后观察其对Caspase3和PAPR裂解的影响，结果显示在TF表达增强的人神经母细胞瘤细胞中，阿霉素诱导的Caspase3和PAPR活化减弱;以Hochest 33342染色也检测到TF表达上调后阿霉素诱导的凋亡细胞数减少。由此初次提示，以基因转染上调人神经母细胞瘤细胞TF表达，可抑制阿霉素诱导的肿瘤细胞;TF在人神经母细胞瘤中的异常高表达可能抑制阿霉素诱导的肿瘤细胞凋亡，提示TF有可能提高肿瘤细胞对化疗药物的耐受性，籍此影响肿瘤的转归及预后。TF抑制化疗药物诱导的肿瘤凋亡可能是其影响肿瘤进展的新机制，此机制可能与其介导的信号转导及其下游信号途径如PI3K/Akt的激活有关，有待今后进行深入的研究。

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