肿瘤坏死因子β G252A、C804A基因多态性与脑梗死的关系

    作者：涂传清， 余卓丽， 王笑碧， 徐 波    作者单位：（1.深圳市宝安人民医院血液科 深圳 518101 2.佛山市血液中心 佛山 528000）     【摘要】  目的 探讨肿瘤坏死因子β（TNFβ）G252A、C804A 多态性与脑梗死（CI）的相关性。方法 采用PCR RFLP及PCRSSP技术研究88例CI患者（CI组）、81例健康者（对照组）TNFβ G252A、C804A 多态性频率。结果 CI组TNFβ C804A基因型（CC型18.2％、CA型47.7％、AA型34.1％）与对照组（38.3％、42.0％、19.7％）相比差异有统计学意义（P<0.05）；其中CI组AA频率为34.1％，对照组为19.7％，两者有显著性统计学意义（P<0.05）；CA+AA基因型CI的风险度为2.101（95％CI为1.048~2.954）；CI组CC基因型为18.2％，对照组为38.3％，两组有显著性统计学意义(P<0.05)；CI组TNFβ G252A基因型频率与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 TNFβ 804A等位基因可能是CI的重要易感基因, 而804C等位基因可能是其保护性因素。TNFβ G252A基因多态性可能与CI无相关性。

    【关键词】  脑梗死； 肿瘤坏死因子β； 聚合酶链反应； 基因多态性

    Association Between Polymorphisms of Tumor Necrosis Factorbeta and Cerebral Infarction

    TU Chuanqing, YU Zhuoli, WANG Xiaobi,  XU Bo.

    (Department of Heamatology, Baoan People’s Hospital, Shenzhen  518101,China)

    Abstract:   Objective  To investigate the association between polymorphism of tumor necrosis factorbeta and cerebral infarction(CI).Methods  Polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism (PCR RFLP) and sequence specific primer PCR (PCRSSP) were used for the detection of TNFbeta genotype in 86 patients with CI and 81 healthy controls.Results  The frequencies of CC, CA and AA genotypes of C804A in CI group and control were 18.2% and 47.7%, 34.1% and 38.3%, 42.0% and 19.7%, respectively; there were statistically significant differences in the distributions of the genotypes (P<0.05) and the allele frequencies (P<0.05) between the two groups; the risk of suffering from CI in those of AA and CA genotypes was 2.101 times that in those of CC genotype (OR=2.011, 95%CI:1.048~2.954). There was no significant difference in the distribution of the genotype of G252A between the two groups （P>0.05）.Conclusion  The single nucleotide polymorphism at position 804 in the exon 3 of TNFbeta gene is associated with CI and the allele A may be a risk factor for CI.The polymorphism of G252A may not play an important role in the pathogenesis of CI.

    Key words:  Cerebral infarction;  Tumor necross factor β;  Polymerase chain reaction;  Gene polymorphism

    脑梗死（cerebral infarction，CI）是一种常见的动脉血栓性疾病, 其血栓形成的机制复杂，可能与多种基因的多态性相关[1]。目前，炎症反应在血栓中的作用已引起广泛注意。血栓形成常伴有炎症反应，炎症部位易形成血栓。肿瘤坏死因子β(tumor necrosis factorβ,TNFβ)是一种促炎因子，在炎症反应和免疫调节中起着重要作用。近年来，国外一些研究发现，TNFβ基因G252A和C804A多态性可影响TNFβ的表达水平, 并可能与动脉血栓性疾病有关[2,3]。国内也有作者对TNFα及TNFβ基因某些位点的多态性与冠心病及CI易感性进行了初步研究，但结果与国外报道不尽一致[4,5]。为了解中国人TNFβ基因G252A和C804A多态性与CI的关系，作者对88例CI患者及81例正常人TNFβ基因多态性进行分析，以探讨中国人TNFβ基因多态性在CI患者发病中的作用及临床意义。

    1  对象和方法

    1.1  研究对象  CI组88例，为深圳市宝安人民医院2005年11月~2006年12月的住院患者，均符合1996年全国脑血管病学术会议修订的诊断标准，并经CT或MRI证实。排除标准：（1）短暂性脑缺血发作者，（2）合并颅内出血者，（3）风心病或房颤并脑栓塞者；其中男47例，女41例，年龄51~79岁，平均年龄60.4±8.9岁。对照组81例，男 47 例，女34例，年龄39~76岁，平均年龄58.9±5.1岁，系本院体检中心健康体检者，按照WHO MONICA方案的危险因素标准，除外心、脑血管疾病。

    1.2  方法

    1.2.1  试剂  DNA分离纯化试剂盒（puregene DNA isolarion kits）为Gentra公司产品；Taq DNA聚合酶、dNTPmix、NcoI 限制性内切酶为MBI Fermentas公司产品；DNA Ladder为BBI公司产品。PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR 清洁试剂盒为Vgene公司产品。

    1.2.2  DNA抽提  清晨空腹抽取外周静脉血2 ml, 以枸橼酸抗凝，用DNA分离试剂盒从全血中分离白细胞的基因组DNA，操作按试剂盒说明进行。

    1.2.3  PCR引物设计及合成  参照有关文献[6,7]设计引物, P1: 5′AGAGCTGGTG GGGACATGTCTG3′； P2: 5′CCGTGCTTCGTGCTTTGGACTA3′； P3: 5′GAGGTGAGCAGCAGGTTTGAGGG3′； P4: 5′GAGGTGAGCAGC AGGTTTGAGGT3′。P1、P2扩增第1内含子至第3外显子的一段基因, 长度为740 bp；P3、P4是针对TNFβ 804等位基因的两条序列特异性引物，分别与P2配对，构成两套内引物，扩增特异性694bp的条带。

    （1）G252A基因型采用PCRRFLP方法鉴定, 扩增体系为50 μl，含引物P1、P2各40 pmol, dNTP 0.05mmol/L，Taq DNA聚合酶2 u，模板DNA 8 μl，10×PCR缓冲液(含25 Mm MgCl2)。扩增条件：95℃预变性6 min，按以下条件循环30次:95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s。末次循环后，72℃再延伸7 min。取10 μl纯化后的PCR扩增产物，加5 u NcoⅠ限制性内切酶于37℃孵育16 h，酶切产物经含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶电泳以确定基因型。

    （2）C804A基因型采用PCRSSP技术鉴定，扩增体系为50 μl，含序列特异性引物P2、P3(或P4)各20 pmol, dNTP 0.05 mmol，Taq DNA聚合酶 2 u，上述P1、P2引物扩增的产物（740 bp）2μl作模板，10×PCR缓冲液(含25Mm MgCl2)。扩增条件：95℃预变性6 min，加入Taq酶，按以下条件循环7次:95℃变性45 s，65℃退火5 s，72℃延伸30 s。末次循环后，72℃再延伸7 min。扩增产物经纯化后用含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶电泳以确定基因型。

    1.3  统计学分析  应用SAS8.0软件包进行统计分析。计量资料组间比较用t检验。计数资料的组间比较采用χ2检验，以双侧P<0.05为有统计学显著性差异。不同基因型与疾病的关系采用Logistic回归分析，关联程度用比值比（Odds Ratio,OR）及其95%可信区间（CI）表示，以OR的95% CI不包含1为统计学上差别有显著性意义。

    2  结    果

    2.1  基因型的确定

    2.1.1  TNFβ  G252A基因型的确定  P1、P2引物扩增的产物为740 bp DNA片段，在这个片段中存在1个NcoⅠ酶切位点，可将此片段切成555 bp、185 bp两个片段。当TNFβ 3号外显子上的252号密码子发生G→A突变时，消除了NcoⅠ酶切位点。所以，当受检个体为GG型时，PCR产物经NcoⅠ酶切后琼脂糖凝胶电泳可见555 bp和185 bp两条带；若为GA杂合子，则可见740 bp、555 bp和185 bp 三条带；若为AA型时，只可见740 bp一条带（图1）。

    图1  TNFβ G252A基因多态性1.5%琼脂糖凝胶电泳结果

    M：DNA分子量参照（100bpDNA）1:740bp的目的基因；2：GA基因型；3：AA基因型；4：GG基因型

    2.1.2  TNFβ  C804A基因型的确定  P3、P4引物的唯一区别在于其最后一个碱基不同，前者为G，后者为T，两者分别与P2配对，构成两套内引物，可扩增出特异性694 bp的条带。只能被P3扩增出694 bp条带的受检个体为CC型；只能被P4扩增出694 bp条带的受检个体为AA型，既能被P3又能P4扩增出694 bp条带的受检个体为CA型（图2）。

    图2  TNFβC804A基因多态性1.5%琼脂糖凝胶电泳结果

    M：DNA分子量参照（100 bpDNA）1:740 bp基因片段；2、3：CC基因型；4、5：CA基因型；6、7：AA基因型

    2.2  基因型频率分析

    2.2.1  TNFβ  C804A基因型频率分析  CI组TNFβ 804位点CC型、CA型、AA型频率分别为18.2％、47.7％、34.1％，而对照组则分别为38.3％、42.0％、19.7％，两组比较差异有统计学意义（χ2＝9.617，P＝0.009）；CI组TNFβ 804位点C和A等位基因频率分别为42.0％、58.0％，对照组分别为59.3％、40.7％，两组比较差异有统计学意义（χ2＝9.998，P＝0.002），见表1。基因频率的相对风险分析发现，AA＋CA基因型发生CI的风险是CC型的2.101倍，95％CI为1.048~2.954。

    2．2.2  TNFβ G252A基因型频率分析  CI组TNFβ G252A基因型分布(GG型34.1%、GA型40.9%、AA型25.0%) 与对照组(24.7%、46.9%、28.4%) 比较，差异无统计学意义(χ2=1.789, P＝0.409)。见表2。表1  CI组与对照组TNFβ C804A基因型频率及等位基因频率比较 表2  CI组与对照组TNF-βG252A基因型频率及等位基因频率比较

    3  讨    论

    TNFβ是TNF家族中重要的成员之一。TNFβ除具有抗肿瘤、抗病毒、免疫调节功能外，近年来还发现TNFβ与血栓形成的发生关系密切。TNFβ可激活中性粒细胞及血管内皮细胞，使其表达细胞间黏附分子1及内皮细胞黏附分子1，从而导致白细胞和内皮细胞间相互作用，释放大量活性氧与弹性蛋白酶，损伤血管内皮细胞，刺激组织因子表达，抑制凝血酶调节蛋白合成，破坏凝血抗凝血平衡，促进血栓形成。TNF亦可抑制血管内皮细胞表达组织纤溶酶原激活剂，并促进纤溶酶原激活剂抑制物1的表达，导致纤溶活性降低，有利于血栓形成[8]。

    研究表明，CI患者血浆中TNFβ水平比正常组高，其原因可能由于CI组的TNFβ 252位点AA基因型频率分布与正常人比较有统计学差异[3,4]。

    Szolnoki等[9]对TNFβ G252A和TNFβ C804A基因多态性与缺血性卒中关系进行了研究，发现缺血性卒中组TNFβ 252G和TNFβ 804C纯合子为13.9%, 而对照组为7.20%, 两组比较差异有显著性(P<0.025), 提示TNFβ 252G 和804C与缺血性卒中的易感性相关。在冠心病的研究中发现，TNFβ 804A等位基因可能是冠心病发生的易感基因，而TNFβ 252G与冠心病病变严重程度有一定关系[5]。

    本文研究结果显示，在中国南方CI患者中TNFβ 804位点CC型、CA型、AA型频率分别为18.2％、47.7％、34.1％，而对照组则分别为38.3％、42.0％、19.7％，两组比较差异有统计学意义（χ2＝9.617，P＝0.009）；CI组TNFβ 804位点C和A等位基因频率分别为42.0％、58.0％，对照组分别为59.3％、40.7％，两组比较差异有统计学意义（χ2＝9.998，P＝0.002）。基因频率的相对风险分析发现，AA＋CA基因型发生CI的风险是CC型的2.101倍，95％CI为1.048~2.954，提示TNFβ 804A等位基因可能是CI的易感因素，这与国内在冠心病方面的研究结论基本一致。CI组TNFβ G252A基因型分布(GG型34.1%、GA型40.9%、AA型25.0%) 与对照组(24.7%、46.9%、28.4%) 比较，差异无统计学意义(χ2=1.789, P＝0.409) ，提示肿瘤坏死因子β G252A基因多态性可能与CI无相关性。

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