白细胞介素6对HL-60细胞NF-κB p65活性的影响
发表时间：2009-06-26 浏览次数：729次
作者：高吉照，薛天阳，许伟 【关键词】 白细胞介素 摘要 :目的 研究白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）对粒细胞白血病细胞系HL-60核因子-κB p65（NF-κB p65）活性的影响，以探讨IL-6在白血病发生、发展中的作用。 方法 指数生长期HL-60细胞置于96孔培养板内RPMI-1640培养液培养2h后，分为A、B2组。A组加PBS液继续培养3h;B组分别加0.5、5、50μg.L的IL-6继续培养3h。用流式细胞仪（FCM）检测HL-60细胞NF-κB p65的活化率。 结果 IL-6浓度为5、50μg.L时诱导的HL-60细胞NF-κB p65活化率分别为（16.81±2.73）%、（22.37±4.29）%，与对照组（8.44±2.20）%相比差异有统计学意义（P<0.05）;IL-6浓度在0.5μg.L时NF-κB p65活化率为（8.69±1.61）%，与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）;3种IL-6浓度组间的NF-κB p65活化率比较差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 IL-6有诱导HL-60细胞NF-κB p65活化的作用，且存在剂量依赖趋势。 关键词 :白细胞介素6;HL-60细胞;核因子-κB p65;活化 The effect of interleukin-6on NF-κB p65activity of HL-60cells GAO Ji-zhao，XUE Tian-yang，XU Wei （Department of Pediatrics，Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou，Jiangsu221002，China） Abstract:Objective To explore the effects of interleukin-6（IL-6）on the activity of nuclear factor kappa B p65（NF-κB p65）in HL-60cells.Methods After being cultured in RPMI-1640for2h，the HL-60cells were divided into A and B groups.The culture was continued for3h，with PBS being added in the media of group A，and IL-6.0.5，5and50μg.L added in the media of the respective subgroups of group B.The activation of NF-κb p65of HL-60cells was deter-mined by flow cytometry（FCM）.Results The rates of activation of NF-κB p65in HL-60cells cultured with IL-65and50μg.L were（16.81±2.73）%and（22.37±4.29）%，respectively，higher than the control（8.44±2.20）%（P<0.05）.The activation was（8.69±1.61）%in the case of IL-60.5μg.L，different from the control insignificantly（P>0.05）.Conclusion IL-6increases the activation of NF-κB p65of HL-60cells in dose-dependent manner. Key words:interleukin-6;HL-60cells;nuclear factor-κB p65;activation 急性白血病是儿童最常见的恶性肿瘤，是一组恶性克隆性疾病，年发病率（3～4）.10万，每年新增病例至少1万例。目前，治疗儿童白血病的方法主要是化疗。随着化疗方案的不断改进，不少小儿白血病的预后已有明显改善，其中小儿急性淋巴细胞白血病5年无病生存率（event free survival，EFS）从20世纪70年代的几乎是0提高到目前的70%以上。然而复发和耐药一直困扰着医务工作者，因此仍然需要不断探索，以进一步提高白血病患儿的长期无病生存率及生活质量。 1 材料和方法 1.1 材料和仪器 HL-60细胞购自中国医学科学院基础医学研究所，兔抗人NF-κB p65单克隆抗体（一抗）、羊抗兔单克隆抗体（二抗）、IL-6均购自北京莱博生物实验材料有限公司。流式细胞仪为美国Calibur公司产品。
1.2 方法 1.2.1 细胞传代 HL-60细胞在RPMI-1640培养基（含15%胎牛血清，2g.L碳酸氢钠，300mg.L葡萄糖，青、链霉素各200U.L）中传代培养，每3～4天传代1次。培养条件:5%CO 2 ，饱和湿度，37℃。
1.2.2 HL-60细胞NF-κB p65活化 指数生长期HL-60细胞1×10 6 .L，置于96孔培养板内，每孔各1ml培养2h后，分为2组。A组加PBS液0.1ml;B组又分为3组，分别加入终浓度为0.5、5、50μg.L的IL-6各0.1ml，各组继续培养3h后待测NF-κB p65活化率。实验重复3遍。 1.2.3 流式细胞仪检测NF-κB p65活性 分别取各组样本1ml，1500r.min离心10min，弃上清;PBS洗涤2次;加1∶50稀释的NF-κB p65一抗（兔抗人单抗）100μl，室温孵育30min，PBS洗涤2次;加1∶50稀释的FITC标记的二抗（鼠抗兔单抗），室温避光孵育30min，PBS洗涤2次;1%副醛固定细胞，4℃冰箱保存，3天内用流式细胞仪检测。每组实验均设阴性对照，阴性对照组只加二抗，不加一抗，余处理同实验组。 1.3 统计学处理 采用SPSS11.5分析统计软件处理数据，试验数据首先进行方差齐性检验和两两比较SNK法检验，两独立样本均数采用t检验，试验数据用ˉx±s，检验水准:α=0.05。 2 结果 IL-6在浓度为5、50μg.L时诱导的HL-60细胞NF-κB p65活化率与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）;在浓度为0.5μg.L时与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。3种IL-6浓度组间HL-60细胞NF-κB p65活化率方差齐性检验F=165.15，P=0.000;3组间两两比较P均<0.05。见表1。 表1 各组HL-60细胞NF-κB p65活化率的比较（略）
与A组比较:#P>0.05，*P<0.05;IL-6组两两比较:P均<0.05 3 讨论 NF-κB是一种多效性的转录因子，参与炎症、免疫、应激、细胞的增殖和细胞凋亡等多种生理、病理过程的基因调节。NF-κB家族由NF-κB.Rel（p65）蛋白家族中的成员以同源或异源二聚体形式存在。1996年，国外3个实验小组报道NF-κB是肿瘤坏死因子（TNF）和化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡耐受的重要因子［1～3］ 。通常情况下，NF-κB和其抑制因子IκB以非活性形式存在于各型细胞的细胞质中，只有被激活后，才从细胞质转位进入细胞核发挥作用。 IL-6生物学功能多样，有促进B细胞分化和急性期蛋白生成、刺激造血、参与炎症反应等作用。IL-6一贯被认为是凋亡抑制因子，它可抑制TGF-β、野生型p53诱导的急性髓系白血病细胞的凋亡。 IL-6和NF-κB之间相互影响，相互作用，共同调节肿瘤细胞增殖、分化和凋亡［4-5］ 。IL-6的分泌有赖于NF-κB的活化，而IL-6反过来又促进NF-κB的活性，使肿瘤细胞免于凋亡，因而IL-6和NF-κB相互促进，形成恶性循环。IL-6促进HL-60细胞NF-κB活化的机制尚不明确，可能是通过JAKs-STATs和Ras-MAPK途径。IL-6诱导形成的受体复合物在胞质内形成了JAKs的结合面，JAKs与受体复合物结合后出现JAKs-受体，JAKs-JAKs的交叉磷酸化和自身磷酸化，再通过磷酸化活化的JAKs募集并活化STATs。活化的STATs形成同源或异源二聚体从胞质移位入细胞核并结合在特定基因的启动子上，激发基因转录。同时，磷酸化的受体可为具有SH2结构的其他蛋白提供结合位点，如HCP、Shc等，并诱导它们的磷酸化活化，再通过Grb2-mSos-Shc募集并磷酸化活化Ras-raf-1-MAP-KK-MAPK，活化NF-κB［6-7］ 。 我们的试验结果显示，IL-6在浓度为5、50μg.L时促进HL-60细胞NF-κB活化;而浓度为0.5μg.L时HL-60细胞NF-κB p65蛋白活化率与对照组相比差异无统计学意义，这与国外文献报道一致。 参考文献 : ［1］ Beg AA，Baltimore D.An essential role for NF-kappa B in preventing TNF-alpha-induced cell death［J］.Science，1996，274（5288）:782-784.
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