DNMT3B基因启动子单核苷酸多态性C46359T与中国北方汉族人群ITP发病的相关性研究

作者：周泽平,李洪强,陈晓梨,许剑辉,顾东生,杜伟廷,张磊,任 倩,杨仁池    作者单位：中国医学科学院血液学研究所血液病医院、实验血液学国家重点实验室，天津 300020     【摘要】  目的 探讨甲基化转移酶家族DNMT3B基因启动子C46359T单核苷酸多态性与特发性血小板减少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP）发病的相关性。方法 采用PCRRFLP结合DNA测序技术检测201例ITP患者及136例正常对照DNMT3B基因启动子C46359T单核苷酸多态性。结果 在ITP患者和正常对照中均未检测到C/C基因型。在正常对照中T/T纯合型和C/T杂合型及T、C等位基因的频率分别为97.8%、2.2%、 98.9% 和1.1%。 ITP患者和正常对照之间的基因型和等位基因频率相比无统计学差异（P值分别为0.745 和 0.747）。ITP患者按年龄和病程分组，儿童组和成人组、儿童急性组和慢性组及成人急性组和慢性组之间的基因型和等位基因的分布均无统计学差异。结论 ITP患者和正常对照的DNMT3B基因启动－149位基因型的基因型分布类似；中国北方人群中，DNMT3B基因启动子－149位基因多态性不能作为ITP易感性的一个预测指标。

    【关键词】  特发性血小板减少性紫癜； DNMT3B ； 多态性

    Single Nucleotide Polymorphism in DNMT3B Promoter and the Risk for Idiopathic Thrombocytopenic Purpurain Chinese Population

    ZHOU Zeping, LI Hongqiang, CHEN Xiaoli, XU Jianhui, GU Dongsheng, DU Weiting, ZHANG Lei, REN Qian, YANG Renchi

    (State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin ，300020，China)

    Abstract： Objective  The purpose of this study was to investigate the association between the single nucleotide polymorphism (SNP) in promoter of the DNMT3B gene and the risk for development of idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP).Methods    Based casecontrol study, the DNMT3B SNP was genotyped in 201 patients with ITP and 136 healthy controls by polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism (PCRRFLP). Results   The C/C genotype was not detected in both the patients with ITP and the controls. In the controls, the frequencies of T/T, C/T genotypes and T, C alleles were 97.8%, 2.2%, 98.9% and 1.1%, respectively. There were no significantly difference in genotype and alleles distribution between the patients with ITP and the controls (P = 0.745 and 0.747, respectively). No significant difference was observed in genotype and alleles distribution between the two groups when stratified by the age and course. The similar results were shown among the four groups patients with ITP: acute childhood, chronic childhood, acute adult and chronic adult. Conclusion   This polymorphism was distributed similarly between the patients with ITP and the controls. It demonstrated that it may not be used as a stratification marker to predict the susceptibility to ITP, at least in the population of north China.

    Key words：    Idiopathic thrombocytopenic purpura; DNA methyltransferase 3B; Polymorphism

    特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP)是一种获得性自身免疫性疾病，是由抗血小板抗体介导的血小板破坏加速及血小板的生成减少所致，其具体发病机制未完全阐明[1]。DNA甲基化是一种表观遗传修饰，对维持T细胞的功能和发育发挥重要的作用[2]，它的异常可以导致自身免疫性疾病的发生[3]。催化DNA甲基化的DNMTs主要包括：DNMT1、 DNMT3A、 DNMT3B 和 DNMT3L。DNMT3B的功能是重新甲基化作用[4,5]。DNMT3B基因启动子区转录起始位点－149 bp处存在C/T(C46359T, GenBank accession no. AL035071)单核苷酸多态性，有研究报道这种突变可以增加启动子区的活性[6]。因此，DNMT3B基因启动子区－149 bp处 C46359T的转换与多种肿瘤，如肺癌、乳腺癌、结肠癌等的相关性已得到关注,且研究表明，T等位基因携带者尤其是CT杂合基因型可以增加肿瘤的发病几率[68]。但关于DNMT3B多态性和ITP临床相关性的研究至今尚未见报道。本研究检测了中国北方汉族人群中ITP患者和正常对照的DNMT3B基因启动子区－149位C46359T及相应基因型的分布，以探讨该位点SNP与ITP发病的相关性。

    1  资料与方法

    1.1  研究对象  本研究中患者和正常对照均来自中国北方，包括201名我院ITP患者，136正常对照是我院工作人员。ITP的诊断符合《血液病诊断与疗效标准》第2版[9]。发病年龄0～14 岁的为儿童ITP，大于14岁者为成人ITP。参与者的一般情况见表1。成人ITP组中有2例失访。基因组DNA的提取按照本实验室常规进行。表1.  ITP病人和正常对照的临床特征

    1.2  通过PCR限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, PCRRFLP)检测DNMT 3B基因型。

    1.2.1  引物设计  管家基因HGH（426 bp）扩增序列为Sense    5′GCCTTCCCAACCATTCCCTTA3′；AntiSense    5′ TCACGGATTTCTGTTG TGTTTC3′。DNMT3B（380 bp）扩增序列为    Sense    5′TGCTGTGACAGGCA GAGCAG  3′；AntiSense    5′  GGTAGCCGGGAACTCCACGG  3′。

    1.2.2  DNMT3B的PCR扩增采用25 μl反应体系,具体如下：10×reaction buffer 2.5 μl；上游引物(10 μΜ/L)    1μl；下游引物(10 μΜ/L)    1 μl；dNTP混合物    0.5 μl；Taq酶    0.3 μl；DNA    50～100 ng；灭菌双蒸水    补至25 ul。反应条件：95℃, 5 min激活热启动酶；随后95℃, 30 s；65℃, 30 s，72℃, 35 s，共35个循环，最后72℃,5 min延伸。1%琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物。

    1.2.3  对PCR产物进行酶切  DNMT3B 启动子区nt 149 (C46359T, GenBank accession no.AL035071) CT的改变形成了AvrⅡ限制性酶切位点。20 μl反应体系：10×reaction buffer    2 μl；DNA≤1 μg；Avr Ⅱ 1 μl；灭菌双蒸水补至20 μl；37°C消化过夜。

    1.2.4  用3%琼脂糖凝胶分析酶切产物  不同的T等位基因的突变 (C/T)形成 AvrⅡ限制性酶切位点，结果形成2个不同大小的条带(207和173 bp)，但野生型C等位基因由于缺乏AvrⅡ限制性酶切位点，因此只有一个380 bp大小的条带。即DNMT3B C/C, T/T和C/T基因型分别出现3种情况：即单个380 bp条带；2条条带(207 bp and 173 bp) 和3条条带(380 bp、207bp和173 bp)。每次PCR反应中以蒸馏水代替DNA模板作为阴性对照。10%的标本重复实验进行质控。

    1.2.5  DNA测序  为了证实DNMT3B 基因型的PCRRFLP 检测结果，随机选择10 份代表性标本进行DNA测序分析。使用ABI 3700 DNA测序仪(PerkinElmer Applied Biosys., Foster City, CA) ，用正向引物检测PCR产物的DNA序列。

    1.3  统计学分析  使用,SPSS 11.5软件进行统计学分析。采用卡方检验或Fisher`s精确概率法。 P<0.05为有统计学意义的标准。Odds ratios(OR)和95%可信区间用于估计基因型的相对危险度。

    2   结    果

    2.1  DNMT3B的PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定  我们首次用PCRRFLP研究了中国ITP患者DNMT3B基因启动子的C/T多态性。DNMT3B的PCR扩增产物长度为380 bp。见图1A。

    2.2  DNMT3B PCR产物经AvrⅡ限制性酶切后的产物片段酶切之后在ITP患者和正常人均只检测到T/T和C/T两种基因型，没有检测到DNMT3B的 C/C基因型。见图1B。

    图1  DNMT3B的PCR产物及其酶切产物琼脂糖凝胶电泳图    A图为PCR产物电泳图:Marker为DL2000,1～6为6例ITP患者DNA的PCR产物，大小是380 bp。B图PCR产物经酶切鉴定基因型的电泳图：1～5的PCR产物经酶切后只有207 bp和173 bp两条带，为T/T基因型；6的PCR产物经酶切后可见380 bp、207 bp和173 bp三条带，为C/T基因型。

    2.3    DNMT3B基因型测序结果  为了确认酶切结果的准确性，选择了10份标本的PCR产物进行DNA测序，得到的测序结果与酶切结果均相一致。其测序结果如图2所示。

    2.4  ITP患者的基因型及等位基因频率分析表2  DNMT3B C46359T在tITP, ITP(≤14岁), ITP (>14岁) 病人和正常人中基因型和等位基因频率的分布

    正常对照组T/T、C/T基因型和T、C等位基因的频率分别是97.8%、2.2%、98.9%和1.1%。ITP患者的T/T、C/T 基因型和T、C等位基因的频率分别是96.5%、3.5%、98.3%和1.7%。ITP患者和正常对照之间的基因型和等位基因频率分布没有统计学差异。根据发病时的年龄，将病人分为2组：发病年龄在0～14岁为儿童组，发病年龄大于14 岁为成人组。我们比较了这两组和正常对照之间DNMT3B的C46359T SNP分布，没有发现统计学差异 。见表2。

    按照病程和年龄，将病人进一步分为4组：儿童急性ITP、儿童慢性ITP、成人急性ITP和成人慢性ITP。我们分别比较了这4组和正常对照之间DNMT3B的C46359T基因型和等位基因分布频率，同样没有发现统计学意义。见表3。表3  DNMT3B C46359T在aITP(≤14岁)、cITP(≤14岁)、 aITP (>14岁)及cITP (>14岁) 病人中基因型

    3  讨    论

    甲基化是DNA合成后的修饰方式之一，在基因表达的表观遗传学调控方面意义重大。DNA调控序列的胞嘧啶甲基化与基因的转录失活相关，而低甲基化则与转录活化相关。DNA的低甲基化与免疫细胞的活化相关 [10]。DNA调控序列的低甲基化不但与T、B淋巴细胞的活化和分化有关 [11]，而且还影响一些细胞因子的表达和分泌，如IL4 和IL6。这些细胞因子可能诱导B淋巴细胞分化为淋巴母细胞产生免疫球蛋白 [12]。最近的研究显示，SLE中存在DNA的低甲基化以及DNMTs 酶活性的降低[13]，这也提示DNA低甲基化在SLE发病中可能的机制。DNA甲基化由甲基转移酶介导，由S腺苷蛋氨酸提供甲基。而DNMT3B是一种十分重要的DNA甲基化酶，它和DNMT2A一起发挥从头甲基化的作用[4, 5]。

    2002年Shen等[6] 发现DNMT3B 转录起始位点上游149 bp 处T等位基因的存在能使DNMT3B 的活性提高30%,使mRNA表达及酶活性增高。目前已证明DNMT3B基因启动子区149位C46359T多态性与很多疾病发病机制相关。它可以改变肿瘤的易感性，如肺癌、乳腺癌、结肠癌及膀胱癌等多种肿瘤。研究认为，DNMT3B SNP 同时含有CT+TT两种不同基因型者，其发生肺癌的风险比C/C基因型者高接近2倍。而在乳腺癌中，同时有C/T 和 C/C 基因型者与T/T 基因型相比有更高的进展为肺癌的风险[15]。

    我们已经发现在ITP中存在DNA低甲基化，并检测到DNMT3B的低表达，推测DNMT3B 的多态性可能改变了甲基化表型进而参与ITP的发病。所以，我们对中国北方ITP患者DNMT3B 启动子区多态性与ITP发病的相关性进行了研究。结果显示，ITP患者和正常对照相比其基因型和等位基因频率没有统计学差异。而且，本研究发现中国人北方汉族人群中没有检测到C/C 基因型，且C/T基因型频率很低，这与其他作者对中国人群的报道相同[16]，也与日本人的结果类似[17]。但与欧美白种人种DNMT3B的基因型分布明显不同。在白种人群，以C/T基因型为主，其次是C/C基因型，而T/T基因型最少[8,15]。中国人群的T/T 基因型占明显优势，可能提示其具有高水平的DNMT3B活性，进而造成中国人和其它种族之间甲基化状态的差异。我们的结果说明，DNMT3B启动子区149 的SNP 可能不参与ITP的发病机制，不能作为预测ITP易感性的分析指标。

    总之，本研究评价了DNMT3B、C46359T、SNP的分布，发现其在ITP发病的遗传型危险因素中可能没有发挥主要作用。进一步研究DNMT 基因的其它多态性可能有助于深入探索ITP的发病机制与遗传学改变之间的关系。

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