丹参酮 ⅡA对免疫性血管炎血小板、骨髓巨核细胞及血管影响的实验研究

作者：李晓静，周 敏，李晓辉，刘 红,徐酉华,杨默    作者单位：成都市儿童医院血液科,成都 610017 重庆医科大学儿童医院血液科，重庆 400014 香港大学李嘉诚医学院儿童及青少年科学系，香港     【摘要】  目的 研究丹参酮ⅡA对血小板及骨髓巨核细胞的影响，探讨其抗血小板作用与其对骨髓巨核细胞影响的关系,了解丹参酮ⅡA是否对免疫性血管炎血管损害有保护作用。方法 建立免疫性血管炎模型，实验分为正常对照组、模型对照组和丹参酮ⅡA治疗组，检测外周血血小板数量，同时检测巨核细胞的数量和功能（CFUMK集落形成能力）以及基质细胞集落（CFUF）形成能力，HE染色、弹力纤维染色及电镜观察血管病理改变。结果 免疫性血管炎模型对照组有血小板数量、骨髓巨核细胞数、CFUMK数的明显增加。丹参酮ⅡA治疗能够明显抑制血小板，血小板数量由模型组的931.33±254.19×109/L降至544.00±83.88×109/L（P<0.05）。也能明显抑制骨髓巨核细胞数和CFUMK，分别为29.17±8.40个/片vs 17.67±5.75个/片（P<0.05）和33.0±14.27个/ 2×105 cells vs 14.67±3.67个/ 2×105 cells（P<0.05）。还能抑制骨髓基质细胞，CFUF数由58.7±14.5个/ 2×106 cells vs 38.8±11.09个/ 2×106cells（P<0.05）。丹参酮ⅡA治疗后血管炎的病理损害有明显减轻。结论 丹参酮ⅡA 可抑制血小板和骨髓巨核细胞的数量，对骨髓巨核细胞和基质细胞的抑制可能是丹参酮ⅡA抑制血小板功能的作用机理之一。丹参酮ⅡA可能通过抑制血小板和巨核细胞而减轻炎症损害，从而使免疫性血管炎血管免受损害而达到治疗目的。

    【关键词】  血管炎; 血小板; 巨核细胞; 丹参酮ⅡA

    Effects of Tanshinone ⅡA on Platelets and Megakaryoccytes in Immune Asculitis

    LI Xiaojing，ZHOU Min，LI Xiaohui, XU Youhua, YANG Mo,

    Department of Hematology, Chengdu Children’s Hospital, Chendou, 610017，China,

    Abstract： Objective  To study the effects of TanshinoneⅡA on platelets and megakaryocytes in immune vasculitis. Methods  The model of immune vasculitis of rabbits were reproduced by intravenous injection of bovine serum albumin twice. Periphery platelet number was detected. The number of megakaryocytes, conolyforming unitmegakaryocyte(CFUMK) and conolyforming unitfibroblast were also assayed. The histologic changes of immune vasculitis were analyzed by hematoxylin and eosin staining, elastic fibers staining and electron microscopy.Results  The platelet number, megakaryocyte number and the number of CFUMK significantly increased in immune vasculitis model group than those in control group. TanshinoneⅡA treatment significantly inhibited platelet from 931.33±254.19×109/L to 544.00±83.88×109/L (P<0.05). The number of megakaryocyte and the bumber of CFUMK also significantly decreased from 29.17±8.40/piece to 17.67±5.75/piece (P<0.05) and from 33.0±14.27/ 2×105 cells to 14.67 3.67/ 2×105 cells (P<0.05). The number of CFUF was significantly lower in aspirin group 58.7±14.5/ 2×106 cells than that in control group 38.8±11.09/ 2×106cells (P<0.05). And TanshinoneⅡA treatment could improve the histologic damage of immune vasculitis.Conclusion  Megakaryocytes and platelets might be involved in the pathogenesis of immune vasculitis, and tanshinoneⅡA could improve the histologic damages of immune vasculitis by inhibiting platelets and megakaryocytes.

    Key words：  Vasculitis；    Platelet；    Megakaryocyte；    TanshinoneⅡA

    丹参酮 ⅡA（tanshinoneⅡA，Tan ⅡA）是从中药丹参中提取的一种成分，具有多种药理作用，如抗血小板，抗炎，抗肿瘤等。前期我们的体外实验发现，TanⅡA能抑制小鼠骨髓巨核细胞生长，并且在体外能诱导巨核细胞凋亡。但体内Tan ⅡA对巨核细胞的作用以及其抗血小板作用与其对骨髓巨核细胞作用的关系，对免疫性血管炎血管损害是否有保护作用，目前报道较少。鉴于临床骨髓标本取材的受限，本实验拟在建立血管炎动物模型的基础上，对上述问题作一探讨。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物及主要试剂  日本大耳幼年家兔(简称幼兔)，周龄3～4周，体重800 g以下，雌雄不拘，由重庆市中药研究所提供。牛血清白蛋白购自上海华美生物工程有限公司。TanⅡA购自上海第一生化药业有限公司。IMDM(iscove’s modified dulbecco’s medium)、小牛血浆(bovine plasma)、小牛血清白蛋白(BSA)、胎牛血清(FCS)购自美国(Gibco, NY)。细胞因子TPO  (thrombopoietin)购自美国(Pepro Tech, NJ)。巨核细胞染色用的乙酰胆碱脂酶(AchE)等化学染色试剂购自美国(Sigma St. Louis)。

    1.2  动物模型的制作  参考Onouchi及韦等[1,2]方法，给予日本大耳幼兔10％牛血清白蛋白2.5 ml/kg静脉缓慢推注，正常对照组给予生理盐水2.5 ml/kg 静脉缓慢推注。2周后，再次依上述方法给药，从而诱发动脉炎，形成血管炎模型。

    1.3    实验分组  （1）正常对照组（normal）；（2）模型对照组（model）；（3）TanⅡA治疗组：TanⅡA 5 mg/kg·d-1，iv，7 d；治疗从第二剂牛血清白蛋白注射后即建模后第4天开始，正常及模型对照组给予生理盐水。每组6只。

    1.4  外周血小板数量的检测  一次性微量采血管取血20 μl，专用稀释液稀释后应用全自动血细胞分析仪(Sysmex KX21，日本)进行血小板数量的检测。采血后1～3 h完成测定。

    1.5  巨核细胞数量的检测  以兔股骨下端为穿刺点，常规操作采集骨髓0.2 ml，涂片，作瑞氏染色,光学显微镜下计数并分类巨核细胞，每张涂片观察范围为1.5 cm×3.0 cm。涂片及计数由专人进行，每份骨髓涂片计数两张，取其平均值。

    1.6  巨核细胞集落（conolyforming unitmegakaryocyte,CFUMK）形成能力的检测－血浆凝块法  无菌采集骨髓1ml，加入含有10 u/ml肝素的IMDM培养液中稀释，用兔淋巴细胞分离液（比重为1. 0965 g/ ml，由天津灏洋生物工程制品科技有限公司提供）密度梯度离心法收集单个核细胞，经IMDM培养液洗涤2次并计数后,取细胞2×105加入到35 ｍｍ培养皿中(Corning,美国),采用血浆凝块法培养观察 CFUMK的生长[3]。其培养体系包括:0.34 mg氯化钙,10%小牛血浆, 1%牛血清白蛋白(BSA，Sigma),1×10-4 2－巯基乙醇,100 u青霉素,100 μg链霉素, TPO 50 ng/ml (PeproTech，Asia)和IMDM培养液,使总量达到1ml,将培养基置于37℃，湿度100%，5% CO2培养箱中培养12 d。12 d后细胞在原位使用1%甲醛固定，然后在室温下过夜干燥,使用乙酰胆碱酯酶染色法和苏木素复染识别巨核细胞集落,显微镜下计算CFUMK。CFUMK集落标准为大于或等于3个巨核细胞。

    1.7  基质细胞集落（conolyforming unitfibroblalase, CFUF）集落培养方法  取2×106骨髓细胞，加入35 mm培养皿中，培养体系2 ml，基本培养基为IMDM，并加入10%FCS、适量的青霉素、链霉素，置入37℃，湿度100%，5% CO2培养箱中培养9 d。第9天细胞原位固定，瑞氏染色后置于倒置显微镜下观察计数CFUF基质细胞集落。20个或20个以上基质细胞聚集一起称为一个CFUF [4]。

    1.8  组织病理学检测  分别于造模后第7天和第28天处死各组动物，小心分离冠状动脉，一部分立即入戊二醛中固定，电镜下观察组织学变化；另一部分立即置人10%中性福尔马林中固定，常规苏木精伊红染色及弹力纤维染色，光镜下观察组织学变化。参考文献[2,5]，病理损害评分标准见表1。表1： 动脉血管病理损害评分方法

    1.9  统计学分析  实验结果以x±s表示，应用SPSS 12.0 统计软件分析数据。采用 单因素方差分析或KruskalWallis秩和检验。相关性分析采用Spearman秩相关分析，P值小于0.05具有统计学意义。

    2  结    果

    2.1  血小板数量的变化  模型对照组血小板数量为931.33±254.19×109/L，较正常对照组640.67±132.22×109/L明显升高（P=0.001）。应用TanⅡA治疗后血小板减少到544.00±83.88×109/L，与模型组比较，差异显著（P＝0.001）。见表2。

    2.2  巨核细胞数量的改变  模型对照组骨髓巨核细胞数量较正常对照组明显升高,为29.17±8.40个/片vs 15.17±5.78个/片，（P＝0.003）。TanⅡA治疗后巨核细胞数量为17.67±5.75个/片，较模型组明显下降（P＝0.01）。见表2。

    2.3  CFUMK形成能力的改变  模型对照组CFUMK形成能力与正常对照组比较明显升高，为33.0±14.27个/ 2×105 cells  vs 17.83±7.89个/ 2×105 cells，差异显著(P＝0.016)。TanⅡA治疗可以明显抑制CFUMK形成能力，集落数为14.67±3.67个/ 2×105 cells，与模型组比较，差异有统计学意义（P＝0.005）。见表2。

    2.4  CFUF形成能力的改变  模型对照组CFUF形成能力较正常对照组有所升高，为58.7±14.5个/ 2×106 cells  vs 42.2±17.7个/ 2×106 cells(P＝0.078)。TanⅡA治疗可以明显抑制CFUF形成能力，集落数为38.8±11.09个/ 2×106cells，与模型组比较，差异显著（P＝0.038）。见表2。 表2：  各组间血小板数量和聚集功能的改变*: P<0.05 vs 正常组；#：P<0.05 vs 模型组；

    2.5  血小板数量、巨核细胞数量和CFUMK相关分析  相关分析显示，血小板计数与骨髓巨核细胞数目及CFUMK形成能力呈正相关（r＝0.411，P＝0.03和r＝0.544，P＝0.002）。血小板数量与CFUF无明显相关性，但CFUMK与CFUF呈相关(r＝0.523，P＝0.009)。

    2.6  各实验组的病理改变  模型组光镜下组织病理学检查结果显示，内皮细胞出现不同程度肿胀、坏死、内皮下组织水肿、血管壁炎性细胞浸润和弹力纤维断裂等改变。电镜检查可见正常血管内皮细胞呈长梭形，与血管长轴同向，平行排列，细胞间连接紧密。模型组则出现不同程度内皮细胞变形、肿胀，排列紊乱，以及脱落呈棉絮状或火山口样。弹力纤维染色显示弹力纤维有不同程度的排列紊乱和纤维断裂。TanⅡA治疗后，上述病理改变有明显减轻(1.83±0.52 vs 3.17±0.75, P<0．05)，差异显著。

    3  讨    论

    近年来的研究显示，血小板除参与机体止血、凝血过程外，还具有炎性细胞的作用。血小板数量增高和异常活化理论在血管炎等诸多疾病的发生发展及病理生理中起着重要作用,并与心血管事件危险性相关[6，7]。但反应性血小板增多性疾病中，是否有骨髓巨核细胞数量和功能的增强，报道较少。我们的研究显示，免疫性血管炎急性期有血小板数量增多，血小板前体细胞－巨核细胞的数量及其集落形成能力也有明显的增强，并且外周血小板数量与骨髓巨核细胞数目及CFUMK形成能力呈正相关。提示在炎性疾病中，血小板反应性增多的原因除了与血小板重新分布,进入血循环增多有关，也与骨髓巨核细胞生成增多有关。炎性细胞因子如IL1、IL  6以及细胞因子TPO等在炎性疾病中的合成与释放增多可能是刺激骨髓巨核细胞生成及血小板产生增加的原因[8]。

    丹参是我国传统的活血化瘀药物，诸多研究显示，其主要成分TanⅡA等具有抑制血小板聚集，抗血栓形成的作用，在心脑血管的治疗上有广泛应用。TanⅡA抗血小板的作用与其提高血小板内cAMP水平、抑制血栓素A等合成以及促进前列环素生成有关[9]。我们的研究发现，TanⅡA不仅对血小板聚集功能有抑制作用（数据未显示），对血小板的生成也有抑制作用，并且对巨核细胞（血小板前体细胞）同样具有抑制作用，巨核细胞数量和集落形成能力均有明显的下降，差异有统计学意义（P<0.05）。结合我们以前的体外实验结果：TanⅡA能抑制小鼠骨髓巨核细胞生长，并且在体外能诱导巨核细胞凋亡，其诱导凋亡的机理主要与TanⅡA破坏线粒体膜的稳定性，使下游caspase3的表达增高有关[10]。因此，TanⅡA减少外周血小板的机制可能主要是通过抑制巨核细胞增殖，促进巨核细胞凋亡，从而减少巨核细胞数量以及减少血小板的生成。

    骨髓基质细胞是骨髓造血干细胞／祖细胞(HSC／HPC)生长发育的重要微环境，其对造血调控起着非常重要的作用。基质细胞通过与HSC／HPC接触和分泌多种细胞因子如SCF、Flt3 ligand、TPO、 IL6和IL11等重要造血细胞因子，调控HSC／HPC的增殖、分化，维持骨髓正常造血。我们的实验结果显示,TanⅡA治疗可以明显抑制免疫性血管炎模型的骨髓基质细胞增殖，CFUF数目明显减少，并且CFUMK数目与CFUF呈相关。提示骨髓基质细胞作为造血的微环境，对巨核细胞生成有着重要的影响。TanⅡA可能通过抑制基质细胞从而调控巨核细胞及血小板的生成。

    病理检查结果显示,血管炎模型组有内皮细胞程度肿胀、坏死，血管壁炎性细胞浸润和弹力纤维断裂等改变，TanⅡA治疗后，上述病理改变有明显减轻。

    综上，我们的实验结果提示：免疫性血管炎急性期存在血小板、巨核细胞数量和功能的异常，巨核细胞和血小板可能参与了免疫性血管炎的病理生理机制。TanⅡA治疗不仅对血小板的生成有抑制作用，对巨核细胞以及骨髓基质细胞同样具有抑制作用，并可能通过抑制巨核细胞和基质细胞，减少血小板的形成及活性，从而减轻炎症的病理损害。为临床应用TanⅡA治疗血小板反应性增多及炎性疾病等，减轻炎症病理损害，并减少因血小板活化引起的血栓栓塞性疾病，使免疫性血管炎的血管免受损害提供理论依据。

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