凝血因子Ⅶ及其受体相互作用的研究进展

作者：张迎红，胡 豫    作者单位：1.武汉科技大学医学院，武汉 430081。2.华中科技大学医学院附属协和医院血液科，武汉 430022。 【关键词】  凝血因子Ⅶ； 组织因子

   1  前    言

    活化形式的凝血因子Ⅶ及其受体组织因子(TF)形成的TF/FⅦa复合物被认为是引发凝血瀑布的关键蛋白。当血管受损伤时，TF暴露，并与FⅦ或FⅦa1∶1结合，TF/FⅦa复合物能增加FⅦa对其底物Ⅸ和FX的蛋白水解活性，所以能激活内、外源性凝血途径。TF/FⅦa复合物在正常生理性止血中发挥着重要作用，并且与血栓性疾病的发生和发展有关，除此之外，TF可在肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞表达，并参与肿瘤血管生成，促进肿瘤生长、浸润与转移。血浆中FⅦ与TF的水平与多种肿瘤的预后、分化等密切相关[1，2]。了解TF、FⅦ结构和相互作用机制对于探讨如何有效干预TF/FⅦa复合物形成，从而防治多种疾病的发生和发展至关重要。本文就近年来关于FⅦ及其受体TF的结构功能、结合机制等方面研究进展作一简要综述。

    2  Ⅶ及其受体的分子结构

    2.1  FⅦ的分子结构  人FⅦ是一种维生素K依赖的单链糖蛋白，由406个氨基酸残基组成，分子量为45.5 ku，加上侧链的糖基，分子量达50 ku。FⅦ的Arg152Ile153之间的肽键裂解后，由单肽链形式转变为双肽链形式，即形成有酶活性的FⅦa。轻链由第1～152位的残基组成，分子量为20 ku；重链由第153～406位的残基组成，分子量为30 ku。轻链与重链由第135位和262位残基之间的单个二硫键连接。人FⅦ有3个重要的区域：“Gla”区：由轻链始端约38个残基构成；“EGF”区，紧接“Gla”区后的两段氨基酸，排列与表皮生长因子相似；“PD”区：是FⅦa重链部分具有催化作用的功能区，氨基酸的排列顺序与丝氨酸蛋白酶家族有显著同源性，因而被称为丝氨酸蛋白酶区(protease domain)。

    目前，除了人FⅦ外的一些哺乳动物FⅦ氨基酸序列已有报道，如兔、小鼠、牛、鸡和斑马鱼。较小的和能广泛运用的动物物种成为发展新药中评估Ⅶ抑制剂在体内活性非常重要的载体。灵长类动物被认为是能较好预测价值来确定评估体内血栓形成模型的有效性，但在临床前筛选的广泛使用中受到限制，而且相当昂贵，较小的动物模型如大鼠或者兔子易于获得，在血栓形成模型中常常优先用来进行针对抗凝有效性的药理学研究。Shobha等[3]克隆并表达了大鼠凝血因子FⅦ（rFⅦ），他们发现，rFⅦ与人和小鼠的FⅦ有高度的序列相似性，人与大鼠约有68%序列完全一致，78%类似，包括Gla部位的所有谷氨酸保守区和参与二硫键的半胱氨酸，在FXa切割位点区域完全相同，但Ⅶ在重链区域丝氨酸蛋白酶功能区的氨基酸序列有明显改变。

    FⅦ基因多态性在血栓性疾病的发生、发展及转归中均有一定意义。人群中常见的FⅦ基因多态性筛查将有助于血栓性疾病的预防及早期治疗。常见的FⅦ基因多态性有R353Q[4]、-3 230/10 bp [5]、IVS7[6]等。10 bp等位基因与低FⅦ活性有关,被认为是心血管疾病的保护因素之一。Steve等对705例健康人进行研究,发现其-3230/10 bp多态性对FⅦc作用比常见的R353Q多态性更强。国内研究发现0/0bp基因型患者的FⅦc、FⅦag比0/10 bp的FⅦc、FⅦag高,体外启动子区-3230/10 bp删除/插入试验也表明,转染等位基因10/10 bp启动子序列,可降低启动子活性33%,影响FⅦ转录,使FⅦc及FⅦag下降,该研究在冠心病患者中检出0/10 bp杂合子的基因频率为8%[7],比国内另一报道的频率(6%)略高[8]，这可能是由于不同群体间存在差异所致。目前关于基因多态性对FⅦc影响的准确分子机制仍不清楚。

    2.2  TF的分子结构  组织因子是一种由263个氨基酸组成的单一多肽链,这些肽链组成糖化膜蛋白。它的分子量是46 ku。可分为3段：1～219位氨基酸构成胞外区，220～242位氨基酸构成跨膜区，243～263位氨基酸残基构成胞内区。胞外区含有3个色赖丝氨酸重复序列，第49与57及第186与209位半胱氨酸分别形成2个二硫键。该区含有4个可与FⅦa结合的关键氨基酸残基；跨膜区含23个氨基酸，为一疏水结构，与磷脂紧密结合；胞内区由21个氨基酸残基组成，其中含3个有功能活性的丝氨酸残基，为蛋白激酶C的作用底物。

    组织因子在不同的细胞中表达,如：平滑肌细胞、纤维细胞、单核细胞、淋巴细胞、粒细胞、血小板和内皮细胞。组织损伤后,这些细胞入血,并快速激活凝血途径。骨髓细胞和内皮细胞仅仅在受到刺激时才表达组织因子，它们可以被炎性细胞、细菌脂多糖和—些微生物激活，未被激活的内皮细胞表面也存在有组织因子,它隐蔽于内皮细胞的空洞里，虽然从结构上能结合Ⅶa,但是与其形成的复合物没有催化活性，不能促进凝血反应的发生。

    3  FⅦ/FⅦa与TF的结合机理

    3.1  FⅦ/FⅦa与TF的结合区域  近几年关于人FⅦ/FⅦa与TF的结合区域的研究很多，但一直未有定论。最早发现的是FⅦa的Gla区，研究者利用组织蛋白酶G的酶解作用和缺Ca2+条件下FⅦa的自分解作用分别产生脱去残基1～38和1～44的FⅦa，FⅦa与TF的亲和性明显降低，说明FⅦa的Gla区对FⅦa与TF结合具有重要影响[9]。但纯化的FⅦa Gla区不能抑制FⅦa与TF的结合，这说明Gla区本身并不含有形成稳定的FⅦaTF复合物所必需的结构成分。Petersen等[10]通过研究指出Gla区的作用在于诱导FⅦa分子发生Ca2+依赖性结构变化，而表达一个或者多个与TF结合的部位。EGF区是涉及与TF结合的另一结构。研究证明，与EGF1区产生特异性结合的单抗能抑制FⅦa与TF的结合[11]。采用以FⅦa轻链与FⅦ重链构成的嵌合体与TF脱辅基蛋白的结合来检验FⅦa与TF结合的区域，结果发现FⅦa轻链的EGF1区具有与TF结合的高度亲和性[12]。此外，有研究证明重链的第195～206的残基可能也参与FⅦa与TF之间的相互作用[13]。Peyvandi等[14]报道了1例患者FⅦ PD区第328位氨基酸突变，造成该患者FⅦ凝血活性低于常人的1%，与TF的结合活性降低了2倍。Nelsestuen等[15]通过对野生型FⅦa进行（P10Q/Q32E）点突变，增强了FⅦa结合TF的能力，但不启动凝血的发生。

    由此看来，目前关于人FⅦ/FⅦa与TF的结合区域主要是Gla区、EGF1区，重链的第195～206氨基酸及其他重链上的区域，但确切的区域还不是十分肯定。目前还没有关于其他哺乳动物研究的报道。

    3.2  FⅦ/FⅦa与TF蛋白相互作用  综上所述，我们可以发现FⅦ/FⅦa与TF的结合情况十分复杂。蛋白与蛋白之间的相互作用对于众多的生物学进程非常重要，如DNA的复制、转录、代谢、信号转导和细胞周期的调控。目前针对蛋白质复合物主要的生理学关联性研究还局限在集中对其特异性的了解和对蛋白的识别，蛋白质之间潜在的结合途径还不是很清楚。这主要是因为监测大分子复合物的具体构象改变和相互接触在技术上比较困难。有报道，sTF上的Trp 45和Tyr 94与FⅦ上的PD区相互作用，Trp 45对于亲和力相当重要,而Tyr 94对于Ⅶ的变构激活很重要[16]。sTF的Phe 140和EGF1相互作用时提供sTF和FⅦ连接的最大能量[17]，另外，sTF Trp 158和Val 207和FⅦaGla区域相互作用也能够提供连接的部分能量[18]。研究还发现，FⅦ的PD区域最先与TF连接，这个部位是亲水性的。Conte等证实PDsTF界面与EGF1sTF界面和GlasTF界面相比包含有大量水分子。这个部位的吸水性使得FⅦ获得良好的吸附TF，对在血管受损后血液中FⅦa:TF复合物的迅速形成有非常大的驱动力，接着FⅦa分子上的EGF1和Gla区域使得它与TF获得并维持牢固的结合，从而有效触发凝血连锁[19]。

    为了进一步了解这些相关事件的一些规律，研究者们采用表面细胞质基因组共振仪监测参与这些过渡状态的能量，运用U值来说明与最终稳定状态相比过渡状态分子结构的形成水平等利用表面细胞质基因组共振仪分析细胞外sTF和凝血因子sTF:FⅦ复合物过渡状态生成能量的不同，结果发现，FⅦ和sTF结合的蛋白质界面分成3个主要的连接部位：蛋白酶区域－sTF界面，EGF1区域－sTF界面，Gla区域－sTF界面，这些包含有FⅦ个别区域的连接部位已经被证实分别地连接到sTF上。能量数据显示过渡状态中PD与STF之间的相互作用多于FⅦ其他部位与STF相互作用，连接的顺序为：首先是PD，再是EGF1,最后是Gla区域。另外，发现FⅦa:sTF复合物的过渡阶段所有部位U值较低，说明为了获得最终的稳定状态的复合物，每个部位不断进行着广泛的结构重排和激活状态的去溶剂化水平[20]。

    4  结    论

    综上所述，FⅦ/FⅦa与TF的结合是一个复杂的过程，虽然目前具体的机制还不能肯定，但众多研究表明，FⅦ上的Gla区、EGF1区和重链上的某些区域对于FⅦa与TF的结合都十分重要，未来的研究需要找到FⅦ最为关键的靶向性片段。

【参考文献】  [1] MORRISSEY JH.Tissue factor: a key molecule in hemostatic and nonhemostatic systems. Int J Hematol,2004,79(2):103108.

[2] CONTRINO JS，HAIR G，KREUTZER DL，et al．In situ detection of tissue factor in vascular endothelial cells：correlation with the malignant phenotype of human breast disease．Nat Med,1996,2(2):209215.

[3] SHOBHA S, KATHLEEN M, CHARITY A,et al. Cloning and expression of rat coagulation factor VII [J].Thrombosis Research,2003,109(4):225231.

[4] JEFFERY S, POLONIECKI J, LEATHAM E,et al. A protective contribution of the Q allele of the R353Q polymorphism of the Factor VII gene in individuals with chronic stable angina[J]. Int J Cardiol,2005,100(3):395399.

[5] FERDINAND M, VANT H, ANGELA S, et al. Two common functional polymorphisms in the promoter region of the coagulation factor Ⅶgene determining plasma factor Ⅶ activity and mass concent ration [J]. Blood ,1999,93(10):34323441.

[6] GIANSILYBLAIZOT M， FLORYPIGAGNIOL L，FAVIER R，et al.Accurate characterization of the IVS7 repeat polymorphism of Ⅶ gene and identification of three novel allelic forms [J].Thromb Haemost,2006,96(1):9597.

[7] 胡豫,徐丹梅,孙春艳,等.冠心病患者凝血因子Ⅶ3 230/10 bp基因多态性的检测[J].临床心血管病杂志,2005,21(12):705707.

[8] 陶蓉,于金德,陆林,等.凝血因子Ⅶ活性与多态性研究[J].中华心血管病杂志,2000,28(1):2729.

[9] WILDGOOSE P,JORGENSEN T,KOMIYAMA Y,et al.The role of phospholipids and the factor VII Gladomain in the interaction of factor VII with tissue factor[J].Thromb Haemost,1992,67(6):679685.

[10] PETERSEN LC，PERSSON E.Effect of Ca2+ on the structure and function of factor Ⅶ[J]． Haemostasis,1996,26(Suppl):4044.

[11] CLARKE BJ, OFOSU FA, SRIDHARA S, et al.The first epidermal growth factor domain of human coagulation factor VII is essential for binding with tissue factor[J]．FEBS Lett,1992,298(2～3):206210.

[12] TOOMEY JR，SMITH KJ，Stafford DW，et al．Localization of the humol/Lan tissue factor recognition determinant of human factor VIIa[J]．J Biol Chem,1991,266(29):1919819202.

[13] KUMAR A，BLUMENTHAL DK，FAIR DS，et al．Identification of molecular sites on factor VII which mediate its assembly and function in the extrinsic pathway activation complex[J]．J Biol Chem,1991,266(2)：915921.

[14] PEYVANDI F，De CRISTOFARO R，AKHAVAN S，et al．Two naturally occurring mutations on FVII gene (S363IW364C) altering intrinsic catalytic activity[J].Thromb Haemost,2002,88(5)：750755.

[15] NELSESTUEN GL, STONE M, MARTINEZ MB, et al. Elevated function of blood clotting factor VIIa mutants that have enhanced affinity for membranes[J].The J of Blol Oglcal Chemistry,2001,276(43):3982539831.

[16] PERSSON E, NIELSEN LS, OLSEN OH.Substitution of aspartic acid for methionine306 in Factor VIIa abolishes the allosteric linkage between the active site and the binding interface with tissue factor[J]. Biochemistry,2001,40(11):32513256.

[17] SCHULLEK JR, RUF W, EDGINGTON TS. Key ligand interface residues in tissue factor contribute independently to factor VIIa binding[J].J Biol Chem,1994,269(30):1939919403.

[18] DITTMAR S, RUF W, EDGINGTON TS.Influence of mutations in tissue factor on the fine specificity on macromolecular substrate activation[J]. Biochem J, 1997,321(3):787793.

[19] LO CONTE L, CHOTHIA C, Janin J.The atomic structure of protein protein recognition sites[J]. J. Mol. Biol,1999,285(5):21772198.

[20] OSTERLUND M, PERSSON, E. Transition state analysis of the complex between coagulation factor VIIa and tissue factor: suggesting a sequential domainbinding pathway[J]. Biochem Biophys Res Commun,2005,327(3):789793.