急性白血病9号染色体微卫星复制错误的研究

作者：赵新东    作者单位：青岛大学医学院血液学教研室，山东 青岛 266021 【摘要】  目的 研究急性白血病（AL）9号染色体微卫星复制错误（RER)现象，探讨微卫星在白血病发病过程中的作用和用于检测染色体微小缺失的意义。方法 选取AL病人53例，其中急性髓细胞白血病(AML)33例，急性淋巴细胞白血病(ALL)20例。在9号染色体共选择5个微卫星位点，对骨髓细胞DNA及作为对照的自身口腔黏膜细胞DNA进行多重PCR扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染，观察微卫星不稳定性(MSI)和杂合性缺失(LOH)的发生情况。结果 53例AL中，共36例发生了至少1个位点的MSI，AML中有15例发生了MSI，10例发生了LOH;ALL中有5例发生了MSI， 4例发生了LOH。其中位于9p21上的D9Sl62、D9S1748、D9S171 微卫星位点LOH发生率分别为0(0/53)、5.7%(3/53)和7.5%(4/53), MSI发生率分别为15.1%(8/53)、7.6%(4/53)和11.3%(6/53)；位于9q34上的D9S61和D9S67位点在AL中LOH发生率分别为11.3%(6/53)和5.6%(3/53)，MSI发生率分别为5.6%(3/53)和9.4%(5/53)。其中D9S61位点LOH均发生于AML，发生率为18.1%，显著高于ALL，差异有显著性（P=0.046）。至少发生2个位点MSI即RER+的有6例，占11.3%。结论AL较高的RER+表达率提示，广泛的MSI与AL的发生发展有关；AML在D9S61上检测出较高的LOH提示，该区域可能存在与AML发生有关的基因改变；微卫星标记技术为研究AL一种新的、有价值的方法。 【关键词】  白血病 染色体 微卫星不稳定性 杂合性缺失　　STUDY OF  MICROSATELLITE REPLICATION ERROR ON CHROMOSOME 9  IN ACUTE LEUKEMIA 　　ZHAO XINDONG, JIAO FEI, WU CHUNMEI, et al　　Department of Hematology, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China　　［ABSTRACT］ Objective To study the function of microsatellite replication error (RER) in chromosome 9 during the pathogenesis of acute leukemia and to investigate the significance of  MSI and LOH in detecting the minima deletions of chromosome.Methods Fiftythree cases of acute leukemia were studied, which included 33 cases of acute myeloblastic leukemia (AML) and 20 cases of acute lymphocytic leukemia (ALL). MSI and LOH in acute leukemia were detected with marrow cells at five microsatellites on chromosome 9 by multiPCR amplification, gel electrophoresis and argentine dye. Normal oral mucosa cells served as controls.  Results Thirtysix cases of acute leukemia demonstrated MSI at one or more loci. In AML, 15 cases showed MSI and 10 cases showed LOH. In ALL, five cases showed MSI and four showed LOH. The frequencies of LOH was 0(0/53), 5.7 %(3/53) and 7.5%(4/53) at D9S162,D9S1748 and D9S171 on 9p21, respectively. The frequencies of MSI in the three microsatellite was 15.1%(8/53), 7.6%(4/53) and 11.3%(6/53), respectively. The frequencies of LOH at D9S61 and D9S67 is 11.3%(6/53) and 5.6%(3/53), respectively. The six cases detected LOH at D9S61 were all AML, the frequency of  LOH in AML (18.1%) was significantly higher than that in ALL. There were six cases (11.3%,RER+) found MSI at no less than two microsatellites.Conclusion The high frequencies of RER+ in acute leukemia indicate that the pathogenesis and progress of acute leukemia is related to the extensive MSI; AML showed significantly higher LOH frequency than ALL at D9S61, which suggests that there may be some gene alterations in AML. The microsatellite technology is a new and valuable method to investigate acute leukemia.

［KEY WORDS］ Leukemia; Chromosomes; Microsatellite instability; Loss of heterozygosity    微卫星是广泛存在于基因组中简单串联式的核苷酸重复序列，约占基因组的5%[1]。微卫星标记属于高信息量的遗传标志，表现为长度的多态性，高度的杂合性，自身突变率低，符合孟德尔遗传规律。因此，微卫星标记已被广泛用于遗传病连锁分析、肿瘤研究等领域。微卫星不稳定性是由于复制错误（RER）引起的简单重复序列的增加（MSI）或缺失（LOH）。研究表明，多种恶性肿瘤可表现出MSI及LOH。因此，对微卫星进行检测以确定染色体的细微改变，进一步寻找和定位与肿瘤发生发展相关基因成为研究肿瘤发生机制的重要方法。大量研究表明，9号染色体短臂，特别是9p2122，在许多实体肿瘤中均可检出较高的LOH，提示9p2122可能存在一组抑癌基因或一个多效性基因[2～6]。9号染色体长臂9q34是白血病常见的染色体易位断裂点，该部位的基因改变可能与白血病的发生有关[7,8]。本研究在9号染色体9p2122和9q34上各选取3个和2个微卫星位点做进一步研究，以探讨微卫星复制错误对急性白血病发病的作用，并确定是否在此区域存在候选的抑癌基因。　　1  材料和方法　  1.1  标本来源　　1.1.1  病例组 　　2002年9月～2004年9月，共收集青岛大学医学院附属医院急性白血病病人标本53例，其中急性髓细胞白血病(AML) 33例，急性淋巴细胞白血病(ALL)20例。 53例病人中男31例，女22例；年龄12～78岁,中位年龄36岁。FAB分型根据《血液病诊断和治疗标准》[9]。　　1.1.2  对照组　　7例标本均来自青岛大学医学院附属医院门诊健康查体者，其中男3例，女4例，年龄17～44岁，中位年龄32岁。　　1.1.3  良性血液病组　　15例良性血液病标本均来自青岛大学医学院附属医院住院病人，包括缺铁性贫血7例，巨幼细胞性贫血4例，血小板减少性紫癜4例；其中男9例，女6例，年龄20～64岁，中位年龄37岁。　　1.2  方法

    病例组采集新鲜骨髓涂片2～3张，或新鲜抗凝骨髓液0.5 mL，置-20 ℃保存备用；同时用消毒竹签刮取病人的口腔黏膜，作为自身对照，放在盛有0.5 mL无菌生理盐水的EP管中，-20 ℃保存备用。良性血液病组标本收集同病例组；健康对照组采集外周静脉血和口腔黏膜。

　　1.2.1  标本DNA的提取

　　①口腔黏膜细胞DNA提取：收集的口腔黏膜标本低温离心后，将收集的沉淀物洗涤2次，加入TE消化液，置37 ℃水浴过夜。然后100 ℃煮沸10 min，低温离心后，检测提取DNA的浓度，-20 ℃保存备用。②骨髓DNA的提取：骨髓标本提取单个核细胞后进行单个核细胞DNA的提取。在提取的DNA 沉淀中加入30 μL TE贮存液，溶解DNA后封口膜封口，-20 ℃冻存备用。③外周血DNA的提取：取全血0.5 mL加入0.5 mL TE混匀，13 000 r/min离心10 min，TE冲洗2次，弃上清。沉淀中加入100 μL TE消化液，37 ℃水浴过夜，100 ℃煮沸10 min，检测提取DNA浓度，-20 ℃保存备用。

　　1.2.2  微卫星位点的选择及引物合成

　　共选择9号染色体上的5个微卫星位点进行研究，其中D9S162、D9S171和D9S1748位于9p21上， D9S61和D9S67位于9q34上，5个微卫星标记的杂合性均大于70%，引物序列见表1。由Genome Data Base（http：//www.gdb.org）查出其引物序列，由上海生工公司合成。

　　1.2.3  多重PCR扩增

　　25 μL反应体系中含有模板DNA 0.25 ng, 4×dNTP各100  μmol/L,引物各10 pmol,Taqplus Ⅰ DNA聚合酶1 U, 10×buffer 2.5 μL(内含Mg2+)。PCR基本反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s，共35个循环； 72 ℃延伸7 min, 4 ℃保存。引物更换时，根据引物碱基组成和长度优化反应条件。

1.2.4  聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染

　　将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳条件为140 V恒压100 min，然后用2 g/L的AgNO3染色，染色后将凝胶电泳结果通过Kodak数码相机或扫描仪输入计算机进行分析。通过与自身对照电泳条带对比，观察微卫星不稳定性及杂合性缺失。

　　1.2.5  结果观察分析

　　①判断样本在该卫星位点是否为有信息的:正常组织来源的标本扩增产物经电泳银染后应出现2条等位基因条带；如果只有1条等位基因条带，则在该位点为非信息的，无法判断其是否发生了MSI和（或）LOH。②判断样本是否有MSI：与病人自身正常组织比较，若某一微卫星位点的等位基因条带增多、减少或位置发生改变，则记为MSI[10]。③判断样本是否有LOH：与病人自身正常组织比较，若某一微卫星位点的等位基因条带消失或相对密度减少50%以上记为LOH[11]，后者可用分子生物学影像分析仪进行分析。表1  所选微卫星引物序列位点（略）  

　　1.2.6  统计学处理

　　采用四格表精确检验法。  

　　2  结 果

　　2.1  对照组

    本文7例健康查体者口腔黏膜细胞和外周血细胞DNA在5个位点进行PCR扩增，对同一引物，每例口腔黏膜与血细胞DNA电泳、银染后得到的两条条带都完全相同。

　　2.2  良性血液病组

    本文15例良性血液病病人口腔黏膜细胞和骨髓细胞的DNA在5个位点进行扩增、电泳、银染后，未发现有MSI或LOH。

　　2.3  病例组

    本文53例急性白血病病人9号染色体的5个微卫星位点，共有13例发生了LOH,其构成比为24.5%，23例发生了MSI,构成比为41.5%。

　　2.3.1  9号染色体的LOH  53例急性白血病病人中分别有4例和3例在D9S171和D9S1748上发生了LOH。在9q34上的D9S61位点和D9S67位点，分别有6例和3例发生了LOH。其中在D9S61位点发生LOH的6例均为AML，AML在这个位点上的LOH发生率为18.1% (6/33),高于ALL (0/20), 差异有显著性 (P=0.046)。53例急性白血病出现LOH的共13例（24.5%）16例次，有3例在2个位点发生了LOH。

　　2.3.2  9号染色体的MSI  处于9p21的3个位点MSI发生率分别为D9S162（15.1%，8/53）、D9S171（11.3%，6/53）和D9S1748（7.6%，4/53）。在9q34上的D9S61和D9S67，分别有3例和5例发生了MSI。53例急性白血病在所选5个位点MSI的发生率为41.5%（23/53），其中3例在2个位点发生了MSI。

　　3  讨 论

    急性白血病病人骨髓和血液中都含有白血病细胞，通常用其口腔黏膜细胞作为对照[12]。本研究中全部采用刮取病人口腔黏膜细胞提取的DNA作为对照，方法简单，结果可靠。

    本研究选择微卫星位点时考虑以下因素：①选择在实体肿瘤研究中选用的9p21区域，实体肿瘤中均有较高的MSI和LOH发生率；②选择微卫星标记位点时考虑到其杂合性的高低，只有具有较高的杂合性（通常大于70%）才可保证研究对象为信息个体；③选择白血病常见的t（9；22）（q34;q11）易位发生区域9q34，以研究这一易位及ABLBCR融合基因的形成是否会使微卫星序列发生变异，导致抑癌基因缺失；④因采用多重PCR技术，应考虑到各微卫星位点应具有不同长度（至少相差40 bp），以根据其电泳迁移率不同将其分开。所以，在9p21上选取了D9S162、D9S171和D9S1748两3个位点，在9q34上选取了D9S61和D9S67等个位点。

    本研究在9p21区域选取的3个微卫星位点均处于新近发现的p16基因附近。所选3个位点中D9S171和D9S1748位点发生LOH者分别为4例和3例，而D9S162位点未见有LOH。这大大低于实体肿瘤中这些位点的LOH发生率,可能有以下几点原因：①在9号染色体短臂上可能存在另外的抑癌基因或p16基因在急性白血病的发病中不占主导地位；②急性白血病的分类和分型复杂，不同的白血病具有不同的细胞遗传学改变，另外急性白血病与实体肿瘤相比，二者染色体改变的方式也不尽相同；③肿瘤的发生是“多步骤”的过程，需要多个基因的共同作用。本研究中9p21区域较低的LOH发生率，也恰恰说明白血病的发生是一个由遗传学改变引导的复杂过程，本研究中所选取微卫星序列的改变在这一过程中可能没有发挥重要作用。

有研究结果表明，95%慢性粒细胞白血病存在t（9；22）（q34;q11）染色体易位。9q34处细胞癌基因cABL与22q11处的断裂点集簇基因（BCR）形成BCRABL融合基因。该融合基因编码相对分子质量为21万的蛋白质，此蛋白质具有增强的酪氨酸蛋白激酶活性，并不受生长因子受体系统的控制，因而使cABL被激活而导致慢性粒细胞白血病[14]。本研究中D9S61位点有6例发生LOH，D9S67位点有3例发生LOH。而对于D9S61位点，AML的LOH发生率为18.1%，明显高于 ALL。吴春梅等[15]对37例慢性粒细胞白血病9号染色体一位点D9S67研究显示，有4例存在微卫星位点的LOH。因此可以推测，在髓系白血病中，9q34处可能存在某种基因改变，使基因表达调控发生变化而发生了髓系白血病。在本研究中，共有16例标本发生了至少1个位点的LOH，占26.2%，其中3例发生了2个位点的LOH。提示白血病的发生发展与染色体的多部位、多步骤改变有关。

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