HLAB*2705重链的原核表达和活性鉴定

HLAB*2705重链的原核表达和活性鉴定作者：李彦博，孙玉英，郭斯启，孙业平，张秀云，孔繁华，奚永志    作者单位：军事医学科学院附属医院免疫学研究室 国家生物医学分析中心免疫分析实验室， 北京 100071    【摘要】  本研究探讨HLAB*2705重链的原核表达及活性鉴定。从HLAB*2705全长cDNA中PCR扩增出膜外区片段并克隆进入pGEMT载体，序列测定后构建原核融合表达载体pET32a（+）B*2705，并转化大肠杆菌。Western Blot 和阻断抗体反应鉴定它们在体外是否具有HLAB27抗原活性。结果表明：HLAB*2705重链融合蛋白在大肠杆菌中获得高效融合表达，表达产量占细菌总蛋白的50%以上；通过Western Blot和阻断抗体反应鉴定它们在体外具有HLAB27抗原活性。结论：本研究获得了HLAB*2705重链融合蛋白，为今后的相关研究打下了基础。    【关键词】  原核表达    Prokaryotic Expression of HLAB*2705 Heavy Chain and Identification for Its Activity  LI YanBo, SUN YuYing, GUO SiQi, SUN YePing, ZHANG XiuYun, KONG FanHua,  XI YongZhi Department of Immunology, Affiliated Hospital of Academy of Military Medical Sciences, Laboratory of Immunoassy, National Center of Biomedical Analysis, Beijing 100039, China    Abstract    In order to investigate the  expression of   heavy chain of HLAB*2705 in prokaryotic system  and identify its activity, the extramembrane gene fragment of HLAB*2705 was amplified from fulllength HLAB*2705 cDNA by PCR and cloned into pGEMT vector.  After  identification by  sequencing, the prokaryotic expressing vector pET32a（+）B*2705 was constructed. The antigenic activity of  expressed protein was identified by Western blot and antibody blocking reaction. The results  indicated that the fused HLAB*2705 protein expression with high efficiency was obtained. The expressed product  was more than 50% of the total  bacteria protein. The antigenic activity of  expressed protein was confirmed by Western blot and antibody blocking reaction. It is  concluded that  HLAB*2705 fusion protein are obtained as basis for the further  studies.    Key words    HLAB*2705 heavy chain; prokaryotic expression; antigenic activity    J Exp Hematol 2007; 15(5):1028-1031    强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS )是致残率较高的脊椎关节病变。脊柱炎症病变从骶髂关节逐渐上升颈椎，晚期致关节变形使患者丧失劳动能力，严重危害生活质量［1］。1973年Brewerton和Schlosstein发现HLAB27和AS之间存在着非常强的关联性［2］。以后的许多研究结果都支持 HLAB27与AS之间在遗传学上的联系。首先，HLAB27与AS的关联性在世界上的许多人群中得到重复［3］；其次，B27转基因大鼠和小鼠可产生多系统自发性炎症，与AS非常相似［4，5］。关于HLAB27分子的致病机制有多种假说，例如分子模拟假说［6］和关节源性肽（arthritogenic peptide）假说［7］等，但证据不足。最近的研究表明，HLAB27存在多种异常形式，如缺乏抗原肽的B27β2微球蛋白复合体、游离B27重链单体、B27重链同源二聚体等［8-10］。这些异常B27可作为自身抗原被CD4+T细胞识别［11］或作为配体被巨噬细胞表达的成对免疫球蛋白样受体（paired Iglike receptors, PIR）［12］识别而导致AS发病。在本研究中，我们用大肠杆菌高效表达了HLAB27抗原中的一个亚型－HLAB*2705重链胞外区，并对其活性进行了初步研究。材料和方法    材料    大肠杆菌DH5α由本室保存， 质粒 pET32a（+）和宿主菌origamiTM（DE3）购自Novagen公司。Tag DNA 聚合酶、pGEMT载体连接试剂盒和质粒提取试剂盒购自Promega公司，DNA回收试剂盒购自LST公司， 小鼠抗人B*2705单克隆抗体购自Serotec公司，碱性磷酸酶标记羊抗小鼠IgG二抗试剂盒及NBT/BCIP显色试剂盒购自华美公司。    引物的设计和合成    PCR扩增引物：上游5′GAATTCGGCTCCCACTCC ATGAGG3′（含Nco I酶切位点）；下游5′GCGCG CCGCTTACCATCTC3′（ 含Not I酶切位点）。上述引物由上海生工生物工程公司合成。    cDNA获得    本室保存有HLAB*2705全长cDNA，已经测序鉴定。PCR扩增：95℃ 预变性10分钟；96℃变性 1分钟，55℃退火 1分钟，70℃延伸 2分钟；共26个循环。DNA回收按试剂盒说明书进行。DNA片段插入T载体参照pGEMT载体连接试剂盒说明书进行。    重组子的挑选、酶切和测序鉴定    将连接产物转化DH5α感受态菌，以IPTG、Xgal氨苄琼脂糖平板筛选，挑取白色克隆培养过夜，小量提取质粒进行Nco I和Not I双酶切鉴定。鉴定的阳性克隆送TaKaRa公司测序。    pET32a（+） B*2705表达载体的构建    将测序鉴定正确的克隆，扩增并提取质粒。以Nco I 和Not I 双酶切并回收DNA片段。pET32a（+）空质粒也同样处理。DNA连接酶连接回收产物。将连接产物转化DH5α感受态菌，以氨苄琼脂糖平板筛选，挑取阳性克隆培养过夜并提取质粒进行Nco I和Not I双酶切鉴定。    重组子诱导表达    鉴定构建正确的表达载体转化origamiTM（DE3）感受态菌，并以卡那霉素、四环素、氨苄三抗琼脂糖平板筛选，挑选阳性克隆进行IPTG诱导表达。诱导方案：从三抗平板上挑选一克隆接种M9培养基过夜；按1∶100接种三抗M9丰富培养基，37℃摇床>250转/分钟，约3.5小时；至OD600=0.5-0.7时，加入IPTG至终浓度0.5-1 mmol/L，37 ℃摇床震摇5小时，收菌。或者，按1∶100接种后在37 ℃下培养5小时以上，至OD600 = 0.8-1.0后，将温度降至22 ℃，加入IPTG，继续培养过夜，收菌。    表达产物的SDSPAGE电泳和Western Blot鉴定    参照分子克隆手册进行，其中Western blot鉴定用的一抗为兔抗人B*2705单克隆抗体，二抗为碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG抗体。    表达产物的阻断抗HLAB27抗体活性的检测    用抗HLAB27抗血清介导的补体依赖性HLAB27阳性淋巴细胞的细胞毒试验验证表达产物的活性。在补体存在的条件下，将从病人体内新鲜分离得到HLAB27阳性淋巴细胞与抗HLAB27抗血清反应，细胞将发生死亡。为考察pET32a (+)/B*2705表达产物的活性，预先将其与抗HLAB27抗血清孵育后再加入细胞和补体，在显微镜下观察活细胞与死细胞的比例。结    果    HLAB*2705重链基因PCR扩增    HLAB*2705重链基因PCR扩增后，得到960 bp的产物（图1）。    Figure 1. Electrophoresis results for the PCR products of HLAB*2705 heavy chain.M： DNA marker. Lane 1:  HLAB*2705    表达载体的酶切鉴定    pET32a (+)/B*2705阳性克隆质粒NcoI/NotI 双酶切，获得约960 bp的B*2705的插入片段（图2）。上述表达载体是在测序正确后构建的。    诱导表达的结果    pET32a (+)/B*2705全菌在37℃及22℃诱导表达后，经变性10% SDSPAGE结果分别见图3A和3B。在47 kD处可见一诱导表达条带。B*2705胞外区共315个氨基酸，经预测分子量大约为34.7  kD，加上融合表达的硫氧还蛋白的分子量12 kD，预期分子量大约为46.7 kD，这与我们的结果基本吻合。经凝胶扫描软件分析，在37℃及22℃诱导所得的产量分别为53.1% (图3A) 和52.4% (图3B)。    Figure 2. Double restriction  of pET32 a (+)B*2705 expression vector.M: DNA marker. Lane 1 and 2:  HLAB*2705.    Figure 3. SDSPAGE of total bacteria protein induced for pET32a (+)/B*2705.  A:protein induced at 37℃. B: protein induced at 22℃. M: protein marker. Lane 1: induced protein of  total bacteria.    不同诱导条件下B*2705的表达形式    诱导表达的全菌经超声碎菌、离心后得到上清和沉淀（包涵体）。将上清与以6 mol/L尿素溶液溶解的包涵体经变性10% SDSPAGE。结果显示，在37℃下诱导，B*2705主要出现在包涵体（图4A），而上清中几乎无表达产物；在22℃的低温下诱导，B*2705主要出现在上清（图4B）。    表达产物的Western blot鉴定    将诱导表达的全菌经超声碎菌、离心后得到上清的进行非变性PAGE，电转移至PVDF膜，经封闭、一抗及二抗作用后用NBT/BCIP试剂盒显色。结果在47 kD出现特异性条带（图5）。同时进行包涵体复性产物Western blot，不显色（数据未给出）。    表达产物的阻断抗HLAB27抗体的活性    在抗HLAB27抗血清介导的补体依赖性HLAB27阳性淋巴细胞的细胞毒的试验中，100%的细胞死亡。若向此实验体系中加入1 μl诱导后的全菌破碎后的上清，90%的细胞毒反应被阻断（图6）。但是，向此实验体系中加入1 μl包涵体复性产物，未能阻断细胞毒反应（数据未给出）。讨    论    HLAB27抗原是一种人主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC）I类分子，由6号染色体MHC区编码的α链及非MHC区编码的β2微球蛋白组成。B27实际上代表1个基因家族，包括1组等位基因，目前已经鉴定了25个等位基因及其编码的24种不同的蛋白(亚型)。这些蛋白命名为HLAB*2701——HLAB*2725（不包含HLAB*2722，因为其与HLAB*2706氨基酸序列相同） ［13］。在所有B27亚型中，B*2705分布最广，几乎见于所有人种。在B27亚型与AS相关性研究中发现，白种人AS患者B*2705亚型占绝大多数（约96%）［14］。在中国汉族B27阳性AS患者中B*2705占41.1%，略低于B*2704（54.8%） ［15］。    本研究中发现，在37℃及22℃下诱导，目的蛋白的产量相当，但表达形式不同。在37℃下诱导，pET32a (+)/B*2705诱导表达的产物主要存在于包涵体，而在22℃下诱导，pET32a (+)/B*2705诱导表达的产物主要以可溶形式存在于上清。包涵体用尿素溶液溶解后，即使经透析复性后，在变性及非变性SDSPAGE后进行Western blot，仍然不能显示特异性条带，也不能阻断抗HLAB27抗体介导的补体依赖性HLAB27阳性淋巴细胞的细胞毒反应（数据未给出）。相反，pET32a (+)/B*2705诱导表达的上清在非变性SDSPAGE后能被抗HLAB27单克隆抗体识别，显示特异性条带。并且，pET32a (+)/B*2705诱导表达的上清能阻断抗HLAB27抗体介导的补体依赖性HLAB27阳性淋巴细胞的细胞毒反应。    在大肠杆菌上清中表达的B*2705缺乏正常人B27分子存在的糖基化，但仍能被Western blot识别，并能阻断细胞毒反应，这说明糖基化对B*2705的活性影响甚微。此外也说明，上清中可能存在使B27分子正确折叠的分子伴侣或折叠酶。而包涵体中的目的蛋白虽然含量高，但复性条件复杂，在本研究中未能取得有效复性。总之，我们获得了上清表达的有活性的HLAB*2705分子胞外区。这为进一步研究HLAB*2705的结构、功能、致病机制及以此为基础的治疗药物筛选作了铺垫。【参考文献】1Kataria RK, Brent LH. 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