γδΤ细胞在获得性纯红细胞再生障碍性贫血发病机制中的作用

γδΤ细胞在获得性纯红细胞再生障碍性贫血发病机制中的作用作者：刘敏    作者单位：四川大学华西医院血液科，血液病研究室，成都 610041    【摘要】  本研究检测获得性纯红细胞再生障碍性贫血（acquired pure red cell aplastic anemia. A PRCA）患者γδT细胞亚群数量和功能变化，探讨γδΤ细胞在APRCA发病机制中的作用。对11例经骨髓涂片和活检确诊的APRCA患者，给予环胞菌素A和雷公藤多甙治疗；采用流式细胞术检测免疫抑制剂治疗前后患者T细胞亚群和γδT细胞水平；分离患者外周血中单个核细胞并置于含有10% FCS. PHA 10 μg/ml. rIL2 50 U/ml的RPMI 1640培养液培养2周，然后用TCRγδ磁珠分选出γδT细胞，在体外与正常人骨髓共同培养，观察对红系、粒系集落生长的影响。结果显示，治疗前组外周血CD3+/CD8+细胞数较正常对照组升高，CD4+/CD8+比例倒置（P<0.05）；治疗前组患者γδT细胞水平有明显升高（P<0.05）。治疗后，有效组CD3+/CD8+细胞数下降（P<0.05），CD4+/CD8+比值上升（P<0.01）；γδT细胞水平较治疗前有明显降低（P<0.05）。从患者外周血分离的γδT细胞体外能抑制正常骨髓红系CFUE和BFUE生长，并随浓度的增长抑制作用越明显，而在不同的浓度梯度下对粒系生长无明显影响。结论： APRCA 患者γδT细胞亚群增高，其在PRCA的发病机制中起了一定作用；体外分离培养的患者γδT细胞可抑制正常红系集落生长，对粒系集落生长影响不明显；环胞素A治疗APRCA有较好疗效。    【关键词】  获得性纯红细胞再生障碍性贫血 细胞免疫 γδT细胞    Role  of  γδT  Cells  in Pathogenesis of Acquired Pure Red Cell Aplastic Anemia  LIU Min. LIU Ting. MENG WenTong. ZHU HuanLing. CUI Xu  Department of Hematology. Hematological Research Laboratory. West China Hospital of Sichuan University. Chengdu 610041. China    Abstract    This study was purposed  to investigate the changes  in quantum and function of γδT cell subsets. and to explore  its significance in pathogenesis of   acquired pure red cell aplastic anemia（APRCA）. Eleven patients were diagnosed as APRCA based on bone marrow smear and biopsy. and were treated with cyclosporine A  and glucosidorum tripterygll totorum. The flow  cytometry technique was used for analyses of T cells subsets and γδT cells. Furthermore. peripheral mononuclear cells（MNC）isolated from APRCA patients were cultured in RPMI 1640 medium （105 cells/ml）   containing  10% FCS. phytohemagglutinin（PHA. 10 μg/ml）. and recombinant human interleukin2（rIL2. 50 U/ml）for two weeks. then γδT cells were isolated with the TCRγδ Microbead Kit from cultured cells. The collected γδT cells were incubated with normal control bone marrow MNC in RPMI 1640 medium（37℃. 5% CO2 atmosphere） for CFUE. CFUGM. and BFUE colony assay. The result showed that   compared with the control group. CD3+.CD8+cells increased significantly in the patient group（P<0.05）. the CD4+/CD8+  ratio decreased and reversed. and γδT cells were significantly increased  in patient group（P<0.05）. After treatment with cyclosporine A. 9 out of 11 patients got good response.  and   CD3+.CD8+ cells  in the responding patient decreased. the ratio of CD4+/CD8+ returned to normal. and γδT cells also decreased to normal range. Moreover.  in vitro culture. the γδT cells isolated from  APRCA patients showed an inhibiting action  to CFUE and BFUE but not to CFUGM in a dosedependent manner.  It is concluded that  γδT cells increase in APRCA patients. and decrease in parallel to normal range with significant improvement of anemia symptoms after immune suppressive therapy. The γδT cells isolated from APRCA patients showed an inhibiting action to CFUE and BFUE but not to CFUGM in vitro culture. suggesting that γδT cells may bring an impact on the research of   APRCA  pathogenesis. Cyclosporine A demonstrated better therapeutic effect on APRCA patients.    Key words    acquired pure red cell aplasia;  cellular immunity;   γδT  cell    J Exp Hematol 2007; 15(1):142-146     近年来的研究表明，T淋巴细胞免疫异常介导的红系损伤对获得性纯红细胞再生障碍性贫血（acquired pure red cell aplastic anemia， APRCA）的发病起着重要作用［1］。我们前期对APRCA患者的外周血T淋巴细胞亚群的研究发现，患者CD3+细胞比例明显增加，其中主要是CD8+细胞亚群的增高，改变了CD4+/CD8+的平衡 ［2］。T细胞依其表面抗原受体（TCR）不同分为TCRαβ T细胞和TCRγδ T细胞两种类型，正常人外周血95%为αβT细胞，仅5%为γδT细胞。Hara等［3］报告1例PRCA患者外周血γδT细胞多达68%，远高于正常范围；体外培养加入患者γδT细胞明显抑制了红系造血。这种γδT细胞亚群的增多是普遍存在于APRCA，还是仅发生在某些特殊病例，这一问题值得探讨。我们采用流式细胞术检测了11例APRCA患者治疗前后外周血T细胞的CD4+细胞、CD8+细胞及γδT细胞亚群的水平，并进一步抽取3例患者外周血进行T细胞培养，免疫磁珠分离出γδT细胞，与正常人骨髓细胞共同培养，观察γδT细胞对红系，粒系造血的影响，以了解γδT细胞在APRCA发病机制中的作用。材料和方法    病例资料    11例APRCA患者均为2003年9月-2004年4月四川大学华西医院血液科门诊或住院病人，其中10例未曾接受过免疫抑制剂治疗，1例为停用环孢菌素后1年复发。男6例，女5例，年龄36-72岁，中位年龄58岁。诊断标准和疗效判定参照张之南《血液病诊断及疗效标准》。正常对照组为23名健康志愿者，年龄22-44岁，中位年龄36岁。

    11例APRCA患者根据接受免疫抑制剂治疗的情况分为治疗前组（11例），有效组（治疗后血红蛋白值恢复正常，或较治疗前升高30 g/L以上，9例），和无效组（未达到上述有效标准者，2例）。治疗方案：环胞菌素A： 6 mg/（kg·d)，分两次服用，血红蛋白＞100 g/L后，加用雷公藤多甙片10 mg，每日3次，同时将环胞菌素A逐渐减量至最小维持量或停药（以维持Hb≥100 g/L为标准）。    实验方法    外周血T细胞亚型分析  分别用三色免疫荧光标记及流式细胞术分析外周血CD4+细胞、CD8+细胞及γδT细胞亚群比例。设两个实验管，分别加入肝素抗凝血100 μl、 3种不同荧光素标记抗体：抗CD3CY5、抗CD4FITC、抗TCRγδPE或抗CD3CY5、抗CD8FITC、抗TCRγδPE（美国Coulter公司产品）各20 μl，室温避光孵育30分钟，加入500 μl红细胞裂解液，用Vortex充分混匀，室温放置30分钟后，上流式细胞仪检测。    T淋巴细胞培养  无菌采集3例患者空腹静脉血5 ml，肝素抗凝。用淋巴细胞分离液分离单个核细胞（MNC）。将1×105/ml MNC 接种于24孔板，每孔1 ml，培养体系为10%胎牛血清，10 μg/ml 植物血凝素，100 U/ml青霉素及100 U/ml链霉素的RPMI 1640培养液，并置37℃、5% CO2、饱和湿度孵箱中培养3天，然后收集细胞，加入培养体系为15%胎牛血清，50  U/ml   rIL2、1×106/ml细胞的RPMI  1640培养液，培养条件同前。每3天换培养液（含rIL2 50  U/ml）1次，培养2周。    γδT细胞的分离  用MiniMACS分离柱（德国美天旎生物技术公司产品）磁性微珠分离。T细胞培养2周后， 800×g离心4分钟，弃上清，收集细胞，加入40 μl  PBS缓冲液，10 μl  TCRγδ haptenantibody，混合后置8℃ 10分钟；再加入30 μl缓冲液和20 μl的antihapten MicrobeadsFITC，混匀后置8℃ 15分钟；接着加入1 ml缓冲液，  800×g离心4分钟，弃上清，用500 μl缓冲液重悬细胞。过MiniMACS磁性分离柱，分离收集γδ T细胞，计数备用。    患者γδT细胞与正常骨髓细胞集落共同培养  取健康志愿者髂骨骨髓5 ml，肝素抗凝，淋巴细胞分离液分离MNC。红系集落培养［4］： 培养体系10-4mol/L巯基乙醇，20%小牛血清，50   U/ml 红细胞生成素，10%白细胞条件培养液PHALCM： MNC数为5×105/ml。分别加入不同量的患者γδT细胞（0、2×10、2×102、2×103、2×104、2×105和5×105/ml）。再加入0.9％甲基纤维素混匀之后，取0.2  ml接种于凹孔板内，每数量级平行接种3孔，置37℃、5% CO2孵箱中培养。CFUE培养7天，BFUE培养14天，联苯胺染色，低倍镜下进行两人盲法计数分析。粒系集落培养：培养体系含22.5%小牛血清，5%正常人AB血清，100  U/ml GMCSF； MNC数为2×105/ml。分别加入不同量的γδ T细胞（0、2×10、2×102、2×103、2×104和2×105/ml）。再加入0.3%琼脂混匀后取1 ml植入培养皿内，每数量级平行接种3孔，置37℃、5% CO2孵箱培养7天，低倍镜下进行两人盲法计数分析。    统计学处理    采用t检验，应用SPSS 10.0数据统计软件分析实验结果。结    果    患者外周血T细胞亚群分析    结果见表1。与正常对照比较，治疗前患者CD3+细胞数明显升高（P<0.05），CD8+细胞显著升高（P<0.05），CD4+/CD8+比值下降并倒置（P<0.05）。经免疫抑制治疗后，有效组9例患者CD3+与CD8+细胞较治疗前组明显减少（P<0.05）。无效组2例患者CD3+细胞数下降，CD4+/CD8+比值较治疗前组无显著差异（P>0.05）。    患者外周血γδT细胞亚群分析    11例APRCA患者（治疗前组），治疗后有效组患者9例，无效组2例，其外周血γδT细胞变化情况见附图和表2。    治疗前患者γδT细胞水平较正常对照明显升高（P<0.05），其中CD8+γδT 细胞比例较CD4+ γδ T细胞多，且存在CD4-CD8-双阴性表达γδT细胞。有效组患者γδT细胞水平较治疗前组显著降低（P<0.05）。采用配对设计的t检验分析，这9例患者的γδT细胞水平较自身治疗前有显著降低（16.0±12.32% vs 4.87±3.68%， P=0.027）。无效组与γδT细胞与治疗前组水平相当。    患者γδT细胞与正常骨髓 MNC共同培养    不同浓度γδT细胞对集落生长的影响见表3。与对照组比较，粒系各组集落产率差异无显著性，而红系集落产率则逐渐降低，且部分有显著性差异，提示患者γδT细胞对粒系生长无影响，而呈剂量依赖性抑制红系生长。讨    论    我们用流式细胞术分析APRCA患者外周血T细胞亚群，结果显示患者CD3+细胞和CD8+细胞亚群较正常对照组明显升高，CD4+/CD8+比值下降并倒置。这结果与Melenhorst等［5］对APRCA患者的研究结果一致，提示T细胞免疫异常介导的红系损伤与APRCA的发病有着极大的联系。T细胞按表面抗原受体（TCR）不同分为TCRαβ和TCRγδ T细胞两种类型。正常人外周血中95%为αβT细胞，仅5%为γδT细胞。近年来研究发现，γδT细胞在某些血液肿瘤和免疫疾病合并APRCA的发病中起了重要的作用［6］。但这种γδT细胞亚群增高的现象在APRCA中是普遍存在的，还是仅发生在某些特殊病例则尚未定论。我们对11例患者进行外周血γδT细胞水平的流式细胞术检测。结果发现，APRCA患者外周血γδT细胞水平为2.9%-34.5%［（15.35±11.30）%］，而正常对照组γδT细胞仅为1.5%-8.3%［（4.69±1.85）%］，患者γδT细胞水平较正常对照显著升高；并且γδ T细胞CD8+表型多于CD4+表型，还存在部分CD4-CD8-γδT细胞。经过免疫抑制剂环胞菌素A治疗的11例患者中，9例获得较好疗效，其γδT细胞水平较治疗前组明显下降；与治疗前作自身对照比较，发现有效组外周血γδ T细胞较治疗前显著下降，提示γδ T细胞数异常与APRCA的红系损伤存在一定联系。另外，环胞菌素A治疗疗效差的2例患者中γδT细胞与治疗前水平相当，均明显高于正常范围，分别为10.5%，13.6%。根据我们的研究结果，这种γδ T细胞亚群的异常可能普遍存在于APRCA患者。    我们将3例患者外周血T细胞培养扩增后，使用与TCRγδ单克隆抗体连接的微型磁珠分离收集γδT细胞，并与正常人骨髓细胞共同培养，发现患者γδT细胞对正常骨髓CFUE和BFUE集落生长有抑制作用，并且随着γδT细胞浓度的增加，对红系集落生长的抑制作用越明显；而不同的浓度的γδT细胞对CFUGM集落的生长抑制作用不明显，但这尚不能提示γδT细胞对粒系生长有抑制作用。临床上该3例患者外周血γδT细胞水平较正常对照增高，而且经环胞菌素A治疗后γδT细胞数下降至正常范围，提示γδT细胞数量增加所致的免疫功能异常可能影响骨髓红系生长，从而引起APRCA的发生发展。Hara等［3］研究报道，这种对红系的抑制作用可完全被CD3单克隆抗体逆转，部分被TCRγδ单克隆抗体逆转，而不能被TCRαβ单克隆抗体抑制。这为在临床治疗中采用抗TCRγδ的单克隆抗体特异性抑制γδT细胞的免疫异常，提出了一个新的途径和理念。    本研究采用环胞菌素A为主的免疫抑制剂治疗11例APRCA，9例患者血象恢复较好，仅2例疗效较差。Totterman等［7］观察了APRCA患者CD8+细胞及产γ干扰素（IFNγ）的淋巴细胞，发现环胞菌素A治疗后有效者中该亚群淋巴细胞下降，而当APRCA复发时则又上升。免疫抑制剂环胞菌素A可选择性地作用于辅助性T细胞（Th）活化初期，与Th细胞胞浆受体蛋白-亲环蛋白（cyclophilin）可逆性地结合，形成环胞菌素Acyclophilin复合物，抑制Ca2+依赖性的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性，阻断细胞浆调节蛋白的去磷酸化，抑制IL2和其它细胞因子如IFNγ基因表达，从而抑制IL2对细胞毒T细胞的激活，同时破坏已激活的细胞毒T细胞，抑制T细胞介导的细胞免疫而起到治疗PRCA的作用［8］。此外，我们使用环胞菌素A治疗前患者γδ T细胞水平较正常对照显著增高，治疗有效组血象恢复的患者γδ T细胞则较治疗前明显下降；而治疗后疗效差者γδ T细胞较治疗前则无明显变化。因而可以进一步推测，免疫抑制剂环胞菌素A对表达TCRγδ的T 细胞可能有一定抑制作用，从而减小对红系造血的影响。    我们的研究结果表明，APRCA患者γδT细胞亚群较正常增高，在APRCA的发病机制中发挥了一定作用；体外激活分离培养的患者γδT细胞可抑制正常红系集落生长，而对粒系集落生长影响不明显；免疫抑制剂环胞素菌A对治疗APRCA有较好的疗效，有效病例γδT细胞亚群比例下降，提示以环胞菌素A为基础的免疫抑制治疗能抑制γδT 细胞亚群的异常增加，是治疗APRCA的一种有效的临床方法。【参考文献】1Handgretinger R. 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