FL，TPO对人脐带血CD34+细胞体外增殖的影响

作者:马天泽,金京春,金春海

【关键词】  配位体;血小板生成素;胎血;细胞学技术

　　 ［摘要］ ［目的］ 研究Flt-3配体（FL）及血小板生成素（TPO）在无血清培养体系中对人脐带血CD34+细胞体外增殖的影响. ［方法］ 采用无血清液体培养法，分别用FL，TPO，FL加TPO作用于体外短期培养脐带血CD34+细胞，利用其计数及集落分析方法评价增殖效果. ［结果］ 分别用FL，TPO，FL加TPO刺激增殖后，人脐带血细胞总数分别增加2.50，5.00，10.10倍，FL加TPO组细胞总数明显高于FL，TPO组;CD34+细胞分别增殖0.90，1.26，1.61倍;集落总数分别增加2.07，2.27，7.37倍，造血祖细胞CFU-GM产率分别提高3.53，2.40，9.95倍，FL加TPO组产率高于其他组，BFU-E产率分别提高1.45，2.25.6.90倍. ［结论］ 在短期无血清液体培养体系中，FL，TPO对人脐带血CD34+细胞均具有增殖作用，且两者具有协同作用.

    ［关键词］  配位体;血小板生成素;胎血;细胞学技术

    Expansion effects of FL，TPO on human umbilical cord blood CD34+cells ex vivo

    MA Tian-ze，JIN Jing-chun，JIN Chun-hai *

    （Department of Hematology，Affiliated Hospital of Yanbian University，Yanji133000，Jilin，China）

    ABSTRACT:OBJECTIVE To investigate the expansion effects of Flt-3ligand（FL）and thrombopoietin（TPO）on human umbilical cord blood CD34+cells.METHODS CD34+cells from cord blood were cultured with FL and TPO alone or combination with the two cytokines in serum-free liquid culture system.The expansion effects were evaluated with cell count，CD34+cells and colony assay.RESULTS The number of nucleated cells increased2.50，5.00and10.10fold in FL，TPO and FL+TPO group respectively，the cell counts of the combination group were higher than control group significantly.Moreover，the number of nucleated cell in FL+TPO group was significantly higher than that of cells in FL or TPO alone.After expansion，the CD34+cells increased0.90，1.26and1.61fold in FL.Clony forming cells（CFC）which remarkable enhanced in all three groups after culture，were increased2.07，2.27and7.37fold.The number of CFU-GM in FL，TPO and FL+TPO group was significantly higher，increased3.53，2.40and9.95fold after culture.The yield of BFU-E was increased1.45fold and2.25fold in FL and TPO group，which enhanced6.90fold in FL+TPO group.CONCLUSION Both FL and TPO can expand CD34+cells from cord bloodfairly in short term serum-free liquid culture，the comnation with FL and TPO showed remarkable synergistic effect.Key words:ligands;thrombopoietin;fetal blood;cytological techniques

    脐带血中的造血干祖细胞量远超过外周血，粒-单核细胞系祖细胞（colony forming unit-granulocyte macrophage，CFU-GM）、红系祖细胞（burst forming units-erythrold，BFU-E）及混合集落形成单位（colony forming unit-mix，CFU-MIX）的产率近似或高于骨髓.脐带血虽富含造血干祖细胞，但因每份脐带血的量有限，通常只有50～150mL，有核细胞数量少，不能满足给成年患者脐带血移植的需要，因此目前脐带血移植多应用于体重小于40kg的患者.造血调控因子对造血干细胞的自我更新和定向分化起重要作用，其中Flt-3配体（FL）和血小板生成素（thrombopoietin，TPO）是作用于早期造血细胞的主要细胞因子.本文利用低氧短期（7d）无血清液体培养体系探讨了FL，TPO单独和联合应用对人脐带血CD34+细胞体外增殖的影响.

1 材料与方法

    1.1 标本采集  脐带血标本收集于天津市第一医院，待新生儿娩出后，将脐带及胎盘血导入无菌瓶内，肝素抗凝，8h内分选.

    1.2 试剂  有FL（Peprotechec，英国）、TPO（沈阳三生制药公司）、QBEND-10抗CD34抗体及羊抗鼠IgG1免疫磁珠（Miltenyi Biotec，德国）、MOPC-21及581直标用荧光抗CD34抗体（PharMingen In-ternational，加拿大）.

    1.3 仪器  所用仪器有Clinic MACS分离系统（Miltenyi Biotec，德国）及FACS流式细胞仪（Bec-ton Dickinson Immunocytometry System，美国）.

　 1.4 脐带血单核细胞（MNC）分离  向采集的脐带血内加入Ficol淋巴细胞分离液，离心分离脐带血内的MNC（1500r/min，20℃，35min），用不含钙及镁离子的缓冲液洗2次，计数备用.

    1.5 脐带血CD34+细胞的分离  利用单克隆抗 体-磁珠分离系统（MACS）进行分离，即加入抗 CD34+抗体QBEND-10及羊抗鼠IgG1免疫磁珠标记细胞，让其通过置于磁场中的分离柱，洗脱CD34+细胞，将分离柱移出磁场，收集CD34+细胞.利用FACS流式细胞仪检测CD34+细胞纯度，其标记荧光抗体为PE结合的581，MOPC-21.

    1.6 脐带血CD34+细胞的体外培养  用Stem Span SFEM无血清培养基配制脐带血CD34+细胞悬液，细胞数量为5×10 8 个/L，接种于24孔培养板中，每孔为1mL，分成空白对照组、FL组、TPO组及FL加TPO组，每组为3～6孔，分别添加相应的细胞因子，置于37℃，50mL/L二氧化碳培养箱中孵育1周.

    1.7 增殖效果的检测  进行细胞计数，计算增殖前后细胞总数之差;用直接标记法检测CD34+细胞数;用CFU-GM，BFU-E，CFU-Mix等集落法分析造血干祖细胞的增殖效果.

    1.8 脐带血CD34+细胞检测  将每份样本分为对照管及实验管，分别加入相应抗体MOPC-21，581，4℃轻摇孵育40min，用PBS洗2次（1000r/m，10min），重新悬浮，加入100g/L多聚甲醛固定，用FACS流式细胞仪测定CD34+细胞比例.

    1.9 造血祖细胞集落半固体培养  采用本实验室建立的甲基纤维素培养体系进行培养，培养基为含有甲基纤维素0.83%，FCS30%，BSA1%，L-谷氨酰胺300μg/L，GM-CSF50μg/L，Epo3ku/L，8×10 8 /L CD34+细胞的IMDM培养基，将其接种于24孔培养板内（每孔为0.5mL，设3个复孔），置于37℃，50mL/L二氧化碳及饱和湿度条件下培养14d.将24孔培养板置于倒置显微镜上计数CFU-GM，BFU-E，CFU-MIX集落数，其总数为造血集落形成细胞（CFC）数.CFU-GM集落标准为集落细胞多于40个，每标本取3个平行孔的平均值作为其CFU-GM产率;BFU-E集落标准为单个集落细胞多于50个或亚集落数多于或等于2个，取每个亚集落细胞多于8个的集落3个平行孔的平均值作为标本的BFU-E产率.体外增殖后CD34+细胞增殖倍数及CFC增殖倍数的公式如下: 增殖倍数=1周后增殖的细胞数×1周后CD34+细胞的纯度增殖前种植的细胞数×增殖前CD34细胞的纯度

    增殖倍数=1周后CFC的产率×1周后增殖的每孔细胞数增殖前CFC的产率×增殖前种植的每孔细胞数 1.10 统计学处理  采用STASTATI5.0软件包对数据进行秩和检验.

    2 结果

    2.1 短期体外增殖后细胞数的变化  FL组、TPO组及FL加TPO组细胞分别增殖2.50（1.07～6.33），5.00（3.33～89.81），10.10（7.33～80.00）倍，分别与空白对照组的1.17（0.40～1.25）比较均有显著增殖效果（P<0.01）;FL加TPO组的细胞增殖数多于FL组及TPO组（P<0.01，P<0.05），TPO组的细胞增殖数明显多于FL组（P<0.05）.

　　2.2 体外增殖后CD34+细胞数的变化  增殖后FL组、TPO组及FL加TPO组CD34+细胞的增殖倍数分别为0.90（0.40～20.24），1.26（0.70～20.00），1.61（0.54～56.60）倍，与空白对照组的0.08（0.06～0.55）比较均有显著性差异（P<0.01），但3组间无显著性差异.

2.3 体外增殖后集落总数的变化  空白对照组、FL组、TPO组及FL加TPO组的增殖倍数分别为0.73（0.64～1.04），2.07（1.49～2.63），2.27（1.39～3.26），7.37（5.10～10.03）倍;实验组增殖倍数均增高，与空白对照组比较均有显著性差异（P<0.01），FL加TPO组的增殖倍数明显高于FL组及TPO组（P<0.01）.

    2.4 体外增殖对CFU-GM，BFU-E等造血祖细胞的增殖作用  FL组、TPO组及FL加TPO组CD34+细胞的CFU-GM产率分别增加3.53（2.21～4.62），2.40（1.52～3.89），9.95（5.82～12.20）倍，与空白对照组的0.95（0.89～1.10）倍相 比较均有显著性差异（P<0.01）;FL组、TPO组及FL加TPO组CD34+细胞的BFU-E产率分别增加1.45（1.11～1.92），2.25（1.34～3.03），6.90（4.73～8.92）倍，与空白对照组的0.62（0.42～0.70）倍相比较均有显著性差异（P<0.01）.

    2.5 集落的形态学特征  在CFU-GM集落中粒系细胞均占60%，单核-巨噬系细胞均占40%.显微镜下FL，TPO增殖的CFU-GM集落细胞小且分散在周围，呈疏散型，部分细胞密集地堆积在一起，细胞数为50～100个;FL加TPO组CFU-GM集落为中央密集的粒系细胞，周围为疏散分布的单核细胞构成的混合型集落，细胞数多于100个.FL组BFU-E产率较TPO组低，两组均多见小BFU-E集落，而FL加TPO组的BFU-E集落多为细胞数多于200个的大集落;虽然FL加TPO组的CFU-MIX集落也可观察到，但产率均较CFU-GM，BFU-E低，CFU-MIX集落以粒-红细胞混合集落为主，未见粒-红-巨噬-巨核细胞混合集落，在粒-红细胞混合集落中红系细胞居于中央，粒系细胞散在于周围，偶见巨噬细胞散在于集落中，见图1.

  3 讨论

    在造血调控过程中造血微环境起重要作用，许多造血细胞因子在此参与造血调控，各尽所责，协调机体的各种反应.随着基因工程技术的发展，已可生产众多种类细胞因子应用于临床和研究.生长因子可在体外促进造血干祖细胞的增殖 ［1，2］ .早期造血干祖细胞的90%以上处于G0/G1期，经细胞因子刺激后可进入增殖周期，并大量增殖和分化，而造血干祖细胞一旦分化即失去自我复制能力，进入定向分化阶段，最终成熟至死亡.近年来研究发现，FL，TPO是具有促进体外造血干细胞增殖的同时亦具有促进造血祖细胞增殖作用的细胞因子 ［3］ .实验结果表明，短期体外培养体系中FL，TPO均有促进增殖作用，两者联合时有协同作用.实验结果亦表明，TPO组的增殖细胞数较FL组多（P<0.05），其原因可能与CD34+细胞中只有少于10%的细胞与FL发生强烈反应，而它们包含在HLA-DR+亚群中有关 ［4］ ，提示FL可能是造血干细胞的生存因子，虽然单独起增殖分化作用较弱，但与其他细胞因子联合作用时可起协同作用.Woudnar-Filipowicz等 ［5］ 报道，在长期液体悬浮培养中，FL促进细胞有丝分裂的能力虽不如其他细胞因子（如SCF），但维持祖细胞能力优于其他细胞因子（如SCF，IL-3，IL-11，G-CSF等）.血液系统的短期造血恢复与克隆形成细胞（CFC）的数量有关 ［6］ ，关系到干细胞移植后粒细胞及血小板的快速恢复.本实验结果表明，FL组、TPO组及FL加TPO组对CFU-GM，BFU-E增殖作用明显优于空白对照组，而FL加TPO组的增殖效果最 佳.Broxmeyer等 ［7］ 发现，FL单独使用时具有微弱 的集落刺激活性，可刺激小而分散的CFU-GM，不能刺激BFU-E.Petzer等 ［8］ 报道，由TPO诱导增殖的长期培养起始细胞进一步分化产生的CFC是红系细胞，其机理尚不清楚，本实验结果亦支持这一点.

 　　［参 考 文 献］

    ［1］ 唐佩弦，杨天楹. 造血细胞培养技术 ［M］.陕西科学技术出版社，1985.105.

    ［2］ 裴雪涛，王立生，徐黎，等.造血生长因子对脐带血CD 34+细胞的体外扩增作用［J］. 中华血液学杂志 ，1996， 17（6）:305.

［3］ 裴雪涛，王立生，徐黎，等.CD34+造血祖细胞的定向 诱导分化研究［J］. 中华血液学杂志， 1998，19（6）:289.

    ［4］ 沈丽琴，顾宗江，张学光.SCF和FLT3配体的造血生 物学功能研究进展［J］. 国外医学输血及血液学分册， 1999，22（4）:221.

    ［5］ Woudnar-Filipowicz A，Chklovskaia E，Manz CY，et al..Effect of flt3ligand on in vitro growth and expansion of colony-fouming bone marrow cells from patients with aplastic anemia［J］.Exp Hematol，1997，25（7）:573.

    ［6］ Sutherland HJ，Eavcs CJ，Lansdorp PM，et al..Differ-  ential regulation of primitive human hematopoietic cells in long-term cultures maintained on genetially engineered murine stromal cells［J］.Blood，1991，78（3）:666.

    ［7］ Broxmeyer HE，Lu L，Cooper S，et al..FLT3ligand stimulates/costimulates the growth of myeloid stem/pro- genitor cells［J］.Exp Hematol，1995，23（10）:1121.

    ［8］ Petzer AL，Hogge DE，Lansdorp PM.Self-renewal of primitive human hematopoietic cells（long-term-culture-initiating cells）in vitro and their expansion in defined medium［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93（4）: 1470.

   （延边大学医院血液科，吉林延吉133000)