蛋白酶体抑制剂对白血病作用的研究进展

蛋白酶体抑制剂对白血病作用的研究进展作者：吕书晴，杨建民，王健民    作者单位：第二军医大学长海医院血液科，上海 200433    【摘要】  蛋白酶体负责细胞内蛋白的降解，其活性的异常改变是肿瘤发生的标志。研究证实，蛋白酶体抑制剂对许多恶性肿瘤有抗癌活性，第一个获准临床试验和上市的蛋白酶体抑制剂硼替佐米治疗多发性骨髓瘤患者获得了较高的总体有效率和完全缓解率。国外学者也开展了一系列蛋白酶体抑制剂对白血病细胞治疗作用的研究，本文就蛋白酶体抑制剂对浆细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、成人T细胞淋巴瘤/白血病、慢性髓系白血病、急性髓系白血病作用的研究进展作一综述。    【关键词】  蛋白酶体    Effects of Proteasome Inhibitors on Leukemias——Review  L  ShuQing,YANG JianMin ,WANG JianMin  Department of Hematology,Changhai Hospital, The Second Military Medical University, Shanghai 200433,China    Abstract    The proteasome is primarily responsible for intracellular protein degradation. The abnormality of  its  activity is sign of tumorigenesis. It was confirmed that proteasome inhibitors have activities against a variety of malignancies.  Bortezomib, the first proteasome inhibitor, obtained permission of  clinical trial and   on sale. Multiple myeloma patients treated with bortezomib have gained a high overall response  rate and complete remission  rate.  A lot of   studies on effects of  proteasome inhibitors on leukemias, including plasma cell leukemia; chronic lymphocytic leukemia, adult T cell lymphoma/leukemia,  chronic  myeloid leukemia  and acute myeloid  leukemia, were reviewed in this article.       Key words    proteasome； proteasome inhibitor；bortezomib; leukemia; multiple myeloma J Exp Hematol 2007; 15(4):896-900    真核细胞内大多数调控细胞生长和凋亡的调节蛋白通过泛素蛋白酶体通路降解，蛋白酶体活性的异常改变，使肿瘤细胞持续性生长，是肿瘤发生的标志。蛋白酶体抑制剂阻止蛋白酶体降解调节蛋白，破坏细胞稳态，诱导细胞凋亡。研究证实，许多恶性细胞株对蛋白酶体抑制剂的敏感性比正常细胞高100-1 000倍。硼替佐米（bortezomib、 PS341、 万珂)是第一个获准临床试验和上市的蛋白酶体抑制剂，体外和体内实验显示对包括骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病、前列腺癌、胰腺癌和结肠癌在内的许多恶性肿瘤有抗癌活性［1］。硼替佐米单用及与其他药物联合治疗复发、难治和初发多发性骨髓瘤患者的临床研究都获得了较高的总体有效率和完全缓解率［2］。硼替佐米治疗复发、难治非霍奇金淋巴瘤的临床试验也肯定了该药在此类疾病中的抗肿瘤效应［3］。国外学者也开展了一系列蛋白酶体抑制剂对白血病治疗作用的研究，下面就蛋白酶体抑制剂治疗白血病的研究进展作一综述。    蛋白酶体抑制剂治疗浆细胞白血病    浆细胞白血病是单克隆丙种球蛋白病中最具侵袭性的一种。EsparisOgando等［4］报道了硼替佐米对4例浆细胞白血病患者分离的肿瘤细胞及1例继发性浆细胞白血病的作用，他在报道中表明硼替佐米减少了浆细胞白血病的肿瘤细胞数量，其生长抑制作用强于地塞米松和阿霉素。硼替佐米诱导了半胱天冬酶原3（procaspase3）和多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）的降解，并减少细胞外信号调节酶(Erk1/2)和磷酸化Erk1/2的数量。将硼替佐米应用于治疗1例以前接受过反复治疗的继发性浆细胞白血病，并伴有严重的贫血和血小板减少的患者，结果外周血中的桨细胞消失，外周血细胞计数恢复到正常水平，不再需要输血。这些资料显示硼替佐米可以应用于浆细胞白血病的治疗。    蛋白酶体抑制剂治疗慢性淋巴细胞白血病（CLL）    蛋白酶体抑制剂作为一种新的抗肿瘤药物治疗B细胞CLL（BCLL）也吸引了很多研究者的兴趣。Pahler等［5］对从100例以上患者中分离的 CLL（BCLL） 细胞给予不同浓度的硼替佐米或其它促凋亡药物，进行凋亡及相关分子的检测。结果显示，尽管诱导细胞死亡的药物浓度存在巨大的异质性，但硼替佐米刺激凋亡的作用比阳性对照(糖皮质激素和氟达拉宾) 更迅速。5例氟达拉宾耐药的患者应用硼替佐米治疗后分离的CLL细胞有2例细胞凋亡水平显著增加。Kelley等［6］在体外用硼替佐米处理分离自CLL病人外周血的淋巴细胞, 并应用流式细胞仪进行凋亡评估，结果发现硼替佐米对CLL细胞的促凋亡作用具剂量和时间依赖性。孵育18 小时后，10 nmol/L的 硼替佐米处理的细胞凋亡百分比较对照细胞增加了 4.27  (±2.57) 倍，体外实验证实了硼替佐米对CLL细胞具有活性，支持将其作为一个有前景的药物进行进一步研究。    蛋白酶体抑制剂对白血病作用的研究进展BCLL的一个主要特征是CD23的高表达，这与细胞的存活有关，受Notch2的调节。Notch信号级联放大通路的几个成分与蛋白酶体的降解紧密相关。Duechler等［7］研究了蛋白酶体抑制剂对Notch2 活性和CD23 表达的作用。蛋白酶体抑制剂可以诱导BCLL细胞的凋亡，CD23表达下调和Notch2 的DNA结合转录活性的下降且呈时间和剂量依赖性。当蛋白酶体抑制剂诱导的凋亡后期过程被caspase 3的抑制而阻止， Notch2活性的减弱仍然可以观察到，提示Notch2活性的减弱在凋亡的早期已经发生。Notch2的过表达可以减弱蛋白酶体抑制剂诱导的BCLL细胞系凋亡。这些资料提示，CD23的下调和Notch2活性的消失是蛋白酶体抑制剂诱导的BCLL细胞凋亡的早期步骤，可能是整个凋亡反应的一部分。    硼替佐米尽管在体外对BCLL细胞具有高度活性，但单独应用于CLL患者的效果却不尽如人意。O′Connor 等［8］报道，在一项Ⅱ期临床试验中3例CLL/SLL患者对硼替佐米治疗完全没有反应，治疗后总的肿瘤负荷没有任何减少。研究者遂将研究重点转向了蛋白酶体抑制剂与其它药物联合应用治疗CLL。Duechler等［9］观察了硼替佐米联合嘌呤类似物，克拉屈宾(2CdA) 和氟达拉宾（FA），对26例BCLL患者的肿瘤细胞的作用。结果发现硼替佐米单药诱导从2.5 nmol/L 低浓度开始呈现出剂量依赖的细胞毒性，诱导BCLL细胞凋亡；2CdA 或 FA与其联合应用显著增强了其细胞毒作用，这种增强作用在5  nmol/L的硼替佐米与亚适量的2CdA 或 FA合用时最显著，不管是单药应用或与2CdA 或 FA联合应用，相对于CD3+ 淋巴细胞，BCLL 细胞对硼替佐米更敏感。在凋亡增加的同时，一些凋亡调节蛋白的表达也发生了改变。Smolewski 等［10］体外研究了硼替佐米联合抗CD20(rituximab，RIT)或抗CD52(campath, CAM)单克隆抗体对 BCLL 细胞的细胞毒作用。发现硼替佐米+RIT或硼替佐米+CAM联合都有累加细胞毒作用，触发了caspase依赖的凋亡。该治疗显著改变了几个凋亡调节蛋白的表达，包括 Bax 的上调，硼替佐米+RIT应用后Bcl2和 Mcl1下调，硼替佐米+CAM 则引起 Bcl2 和 XIAP 的下调。这些数据表明联合这些药物治疗 BCLL是可行的。    总之，蛋白酶体抑制剂如硼替佐米，特别是与现有药物联合，可能是治疗BCLL的一种新策略。    蛋白酶体抑制剂治疗成人T细胞淋巴瘤/白血病（ATL）成人T细胞白血病是来源于CD4阳性T淋巴细胞的高度侵袭性的恶性肿瘤 ，尽管经过强烈化疗，其平均生存时间仍然少于1年。NFκB激活在人类T淋巴细胞病毒Ⅰ（HTLVⅠ）相关的恶性疾病的发病机制中扮演了重要作用，可能与肿瘤生成和抗癌药物的耐药、凋亡有关。蛋白酶体抑制剂是控制HTLVⅠ感染的T细胞内 NFκB的结构性活化的一种有效手段。Tan等［11］报道，蛋白酶体抑制剂硼替佐米通过阻止IκBα的降解减弱了NFκB 的DNA 结合活性，在鼠T细胞白血病模型中硼替佐米单独应用没有延长荷瘤小鼠的生存时间，然而，当硼替佐米与目前临床上应用的人源化抗Tac单克隆抗体联合，使一部分治疗动物获得了完全缓解，而单用抗Tac单克隆抗体的动物只观察到部分缓解。Satou等［12］也研究了硼替佐米体内外对 ATL 细胞的作用，证实硼替佐米可以抑制ATL 细胞内IκBα的降解，导致NFκB的抑制，并可诱导ATL细胞的死亡。尽管大多数细胞的死亡是凋亡，当caspase抑制剂zVADfmk存在时，也可以观察到细胞坏死。给予荷瘤的SCID小鼠硼替佐米，可以抑制肿瘤在体内的生长，提示硼替佐米在体内可以有效对抗 ATL 细胞。    Nasr等［13］的研究证实，硼替佐米能抑制新鲜的ATL细胞和HTLVⅠ转化的及HTLVⅠ阴性的恶性T细胞的增殖并诱导其凋亡，而正常的静息或激活的T淋巴细胞对其耐受，硼替佐米与阿霉素和依托泊甙联合具有协同生长抑制作用。硼替佐米影响了多条HTLVⅠ阳性和阴性恶性T细胞存活关键的通路，主要与IκB /NFκB途径有关，另外涉及 P21, P27和P53 蛋白的稳定，神经酰胺的积聚和相关的凋亡等。MitraKaushik 等［14］观察了硼替佐米对HTLVⅠ Tax转基因鼠肿瘤的体内和体外作用 ，也证实硼替佐米对细胞生长的作用大部分与NFκB介导的细胞通路抑制有关。 然而，硼替佐米对Tax转基因鼠肿瘤生长的作用表现出药物反应的异质性，硼替佐米处理后的肿瘤组织没有显示NFκB 体内活性的持续抑制。另一方面，移植了Tax肿瘤的Rag1鼠对同样的药物治疗方案表现出持续的肿瘤生长抑制作用和生存期延长。TUNEL 染色表明，硼替佐米处理使Tax肿瘤对DNA 断裂更敏感。    上述研究揭示，硼替佐米在体内外可以高度选择性地诱导ATL细胞凋亡。硼替佐米单药或联合化疗在ATL中具有潜在的治疗价值。该药的临床应用可能改善该致死性疾病患者的预后。    蛋白酶体抑制剂治疗慢性髓系白血病（CML）95%以上CML患者存在特异的bcr/abl融合基因，其预后由于异基因造血干细胞移植和甲磺酸伊马替尼（格列卫）的应用而大为改善，但仍有一部分患者因为没有适宜的供体以及对伊马替尼产生耐药等原因而需要新的治疗方法。Gatto等［15］研究证实，硼替佐米对bcr/abl阳性的伊马替尼敏感细胞系(p210Bcr/Abl KBM5, p210Bcr/Abl KBM7, and p190Bcr/Abl Z119)和伊马替尼耐药的细胞系(KBM5R)都表现出明显的生长抑制作用。这种现象与G2/M期细胞的积累有关，出现NFκB DNA 结合活性的短暂下调、BclxL的下调、caspase 3的激活、凋亡的诱导、 bcr/abl表达和磷酸化的抑制。序贯给予硼替佐米和伊马替尼具有协同促凋亡作用，但同时给予却具有拮抗作用。因此硼替佐米可探索性应用于伊马替尼耐药的CML治疗，但硼替佐米和伊马替尼的联合应用时应注意两者给药的时间。    蛋白酶体抑制剂和其它靶向药物联合治疗CML也显示出乐观的前景。    Yu等［16］报道，蛋白酶体抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂联合应用对 Bcr/Abl阳性人白血病细胞系（K562 和LAMA 84）具有协同作用。同时给予硼替佐米和去乙酰化酶抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸（suberoylanilide hydroxamic acid， SAHA) 或丁酸钠（sodium butyrate， SB) ，显著增强了线粒体的损伤、caspase的激活及细胞凋亡，硼替佐米和SAHA联合还可使活性氧簇（reactive oxygen species, ROS）生成增加和NFκB激活减少。另外，本方案能诱导伊马替尼耐药的K562细胞和分离自伊马替尼耐药病人的 CD34+单个核细胞凋亡。蛋白酶体抑制剂和细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂联合对bcr/abl阳性的人白血病细胞也有协同作用。Dai等［17］发现，同时给予硼替佐米和细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂flavopiridol可以导致K562 和 LAMA84细胞线粒体功能紊乱和凋亡增加。对伊马替尼耐药的 K562细胞存在bcr/abl 表达的增加，硼替佐米和flavopiridol 的处理显著增加了凋亡，这与bcr/abl 和BclxL的下调及Lyn、Hck、CrkL和 Akt磷酸化的减少有关。对伊马替尼耐药的LAMA84细胞bcr/abl 的表达下调，但Lyn 和Hck的表达和活化显著增强，Flavopiridol/硼替佐米诱导的凋亡与 Lyn 和 Hck 的灭活有关。Dasmahapatra等［18］检测了酪氨酸磷酸化抑制剂adaphostin和硼替唑米对由于bcr/abl点突变而对伊马替尼耐药的bcr/abl阳性的白血病细胞的作用。发现adaphostin和硼替唑米在诱导野生型和突变细胞（包括T315I突变体）凋亡时均有协同作用。    Servida等［19］报道了蛋白酶体抑制剂PSI在体外可激发许多化疗药物对髓系白血病细胞系的细胞毒作用，而且与治疗剂量的硼替佐米具有协同作用。从CML病人分离的CD34+骨髓前体细胞比来自正常人的对PSI 更敏感 (IC50分别为15 和 50 nmol/L)，另外，正常的早期前体细胞 (LTCIC) 在PSI 浓度为15 nmol/L时未受影响。这些发现都支持进一步的PSI治疗CML的临床前研究。    以上研究表明，对CML患者，特别是伊马替尼耐药者，蛋白酶体抑制剂单药应用或与其他药物联合具有潜在的价值，值得进一步进行临床前研究和相关的临床试验。    蛋白酶体抑制剂治疗急性髓系白血病（AML）尽管化疗对许多AML患者有效，仍有很多患者复发或耐药，这些病人需要新的治疗。蛋白酶体抑制剂是一个潜在的治疗选择。体外试验表明，许多白血病细胞系（Jurkat、HL60、U937、K562）对蛋白酶体抑制剂敏感［20］。Yu等［21］报道，硼替佐米处理Jurkat淋巴母细胞或U937 粒单白血病细胞导致JNK和p38MAPK的激活，ERK1/2的灭活，细胞色素C的释放，caspase 9、3、 8 激活和细胞凋亡。    同CML一样，蛋白酶体抑制剂和多种其它靶向治疗药物对AML细胞也有协同作用。Dai等［22］报道，同时给予U937粒单白血病细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂flavopiridol 和蛋白酶体抑制剂 MG132，可协同诱导显著的线粒体损伤、caspase激活和细胞死亡，并伴随集落形成潜能显著下降。相似的作用可以在其他蛋白酶体抑制剂硼替佐米（乳胞素lactacystin、LLnL）和细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂 (如 roscovitine)，和其他白血病细胞类型 (如 HL60, Jurkat, Raji)见到。在U937细胞， MG132和 flavopiridol 的协同作用与对信号或生存相关蛋白表达或激活的多重干扰相关。进一步实验揭示，蛋白酶体抑制剂显著降低了受药理学浓度细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂作用的白血病细胞的凋亡阈，其中NFκB 细胞保护途径的干扰和JNK激活在这种现象中起着重要的作用。因此，联合应用蛋白酶体抑制剂和细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂可能作为一个新的抗白血病策略。Dasmahapatra等［23］在多个人白血病细胞系和原代的AML标本中观察到酪氨酸磷酸化抑制剂adaphostin 和蛋白酶体抑制剂（MG132、硼替佐米）可以协同促进细胞凋亡，这种作用与ROS产生、Raf/MEK/ERK 通路的下调、JNK激活有关。Sutheesophon等［24］实验研究表明，组蛋白去乙酰化酶抑制剂缩酚酸肽（FK228）和硼替佐米对人髓系白血病细胞系HL60 和 K562细胞具有协同作用，硼替佐米显著增强FK228诱导的细胞凋亡和Bax的线粒体易位。上述研究表明，蛋白酶体抑制剂和其它靶向治疗药物联合应用是值得关注的抗白血病策略。    Horton等［25］研究证实，原代的白血病淋巴母细胞和白血病细胞系都对硼替佐米敏感；对硼替佐米和其他药物间的相互作用进行了定性和定量的分析证实，硼替佐米与地塞米松对地塞米松敏感的白血病细胞有协同作用，与长春新碱、阿霉素、阿糖胞苷、门冬氨酸酶有叠加作用，硼替佐米的抗白血病活性也与格尔德霉素、bcl2 抑制剂HA14.1有叠加作用，与曲古抑菌素A有叠加或协同作用。这些证据揭示了硼替佐米可以激发联合化疗对白血病细胞的细胞毒作用。Cortes 等［26］对复发和难治性白血病患者进行了Ⅰ期临床研究表明，急性白血病患者对硼替佐米的最大耐受剂量为1.25 mg/ m2，剂量限制性毒性包括直立性低血压、恶心、腹泻和液体潴留, 都发生在 1.5 mg/ m2 剂量组。5例患者的白血病细胞体外与硼替佐米共孵育后，有3例显示诱导凋亡，一些患者身上观察到短暂的血液学改善，这提示硼替佐米对急性白血病的治疗作用值得进一步研究，但可能需要与其它药物联合治疗。Orlowski等［27］的临床研究表明，硼替佐米和脂质体阿霉素联合应用治疗进展期恶性血液病患者是安全的，硼替佐米可以在体外、体内增强蒽环类抗生素的抗肿瘤作用，1例应用此方案的AML患者达到部分缓解。    与CML一样， 蛋白酶体抑制剂 PSI在体外对AML细胞具有潜在的细胞毒作用, PSI抑制 AML细胞生长的作用强于PS341。PSI对从AML病人和正常人骨髓CD34+前体细胞的IC50分别为5 和50 nmol/L［19］，表明PSI可能对AML具有较好的治疗前景。    目前，应用蛋白酶体抑制剂治疗白血病病人的临床资料尚不多。体外实验研究结果表明，其与许多药物有协同作用，并且可以增强联合化疗对白血病细胞的细胞毒作用，克服白血病细胞的耐药性，因此值得临床进一步研究。【参考文献】  1 Adams J. 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