姜黄素衍生物Fm04抑制K562细胞增殖及其对P210bcr/abl信号通路的影响

作者：李娜, 吴丽贤, 温彩霞, 黄秀旺, 许建华   

作者单位：福建医科大学药学院临床药理研究所,福州 350004

【摘要】  目的 研究姜黄素衍生物Fm04对K562细胞的增殖及对P210bcr/abl信号通路的影响。 方法 应用MTT法检测姜黄素衍生物Fm04对K562细胞增殖的影响;应用Western blot法检测P210bcr/abl及其下游通路蛋白表达的变化和线粒体细胞色素C的变化;比色法测定Caspase3、Caspase9活化程度。 结果 Fm04对K562细胞的抑制作用呈量效、时效关系,4 μmol/L Fm04作用24 h,抑制率88.4%,半数抑制浓度1.45 μmol/L,强度约为姜黄素的7倍;Western blot表明Fm04可显著下调P210bcr/abl及其下游信号通路蛋白,减少细胞线粒体内细胞色素C含量; Fm04处理组Caspase3、Caspase9浓度值增加。 结论 Fm04显著抑制K562细胞的增殖并减少P210的蛋白含量从而下调P210bcr/abl下游多种信号分子表达,通过激活caspase的活化和线粒体内细胞色素C的释放,最终诱导K562细胞的凋亡。

【关键词】  姜黄素; 细胞凋亡; 白血病,髓样,慢性; 融和蛋白质类; bcrabl; K562细胞; 信号传导

　　ABSTRACT:  Objective  To study the apoptosisinducing effects of the synthetical curcumin derivative Fm04 on chronic myelogenous leukemia(CML) cell.  Methods  MTT was used to determine the apoptotic effects of Fm04 on K562 cells.  The signal protein molecules expressed in K562 cells was examined by Western Blotting.  The spectrophotometer kit was used to detect the activity of Caspase3 and Caspase9.  Results  Exposure of K562 cells to Fm04 produced both concentrationand timedependent increase in the antiproliferative rate.  K562 cells were much more sensitive to fm04 than to curcumin, 4 μmoL/L Fm04 for 24 h the inhibiting rats reached 88.4% and the IC50 of Fm04 was 1.45 μmol/L.  Moreover, the level of P2l0bcr/abl as well as the downstream signal protein was strongly downregulated in fm04treated K562 cells, and the D value of Caspase3 and Caspase9 was upregulated in Fm04treated K562 cells.  Conclusion  Fm04 exhibits stronger activity in inducing apoptosis in chronic myelogenous leukemia(CML) cells than curcumin by having stronger activity of the downregulation of the P2l0bcr/abl and other proteins, and by activing the caspase cascades and inducing the stronger release of cytochrome C from mitochondria.  Fm04 might be worthy of being considered as a potential chemotherapeutic agent of CML.    　　KEY WORDS:  curcumin derivative; apoptosis; leukemia; P210bcr/abl

　　姜黄素(curcumin,Cur)系从姜黄中提取的酚性有效单体化合物,具有抗肿瘤、抗氧化、抗突变、抗炎、抗血小板聚集等广泛的药理作用[1]。近年来,有关姜黄素的药理学研究尤其在抑制细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡等方面的作用日益受到重视，并发现Cur与STI571体外联合应用可明显协同下调P210bcr/ab1的表达水平，这对于降低慢性粒细胞白血病对STI571的耐药性的一定的意义[2]。但姜黄素水溶性差,水溶液易水解,首过消除现象明显,生物利用度低,成为限制其临床应用的主要因素和产业化的瓶颈[3]。本实验保留分子中共扼β二酮链等活性必需基团,设计合成新的姜黄素衍生物Fm04。    　　P210bcr/abl融合蛋白定位于细胞质内,依靠Bcr的双聚体区,以形成二聚体。P210bcr/abl蛋白可通过其酪氨酸激酶(PTK)的持续激活而活化下游相关的信号转导通路,包括Ras/MAPK、PI3K、Erk、NFκB、JakSTAT 通路等[49],并阻断线粒体内的细胞色素C(CytC)的释放引起caspases级联的激活[10],从而阻止细胞凋亡,导致细胞过度增殖,是治疗慢性粒细胞白血病的分子靶点。笔者以K562细胞为模型,对新合成姜黄素衍生物Fm04的体外抗慢性粒细胞白血病细胞活性进行初步评价及探讨。

1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  药品与试剂  姜黄素(上海试剂三厂,批号980825),纯度99%;姜黄素衍生物Fm04由本实验室合成并提纯,经核磁共振光谱验证,经HPLC及薄层层析分析鉴定,纯度>90%;Western blot试剂盒[普洛麦格(北京)生物技术有限公司];抗ABL单克隆抗体、Erk1/2、pErk、AKT、pAKT、CytC、NFκB(P65)、βactin抗体(美国Santa Cruz公司);Caspase3、Caspase9分光光度法检测试剂盒(南京凯基生物发展有限公司)。

　　1.1.2  细胞株及培养条件  人慢性粒细胞白血病细胞株K562(中科院上海细胞研究所),培养于含10%新生牛血清,1×108U/L青霉素及100 mg/L链霉素的 RPMI 1640培养液,在37 ℃、体积分数为0.05、 饱和湿度的CO2培养箱培养。细胞接种24 h后进入指数增长期。

　　1.2  方法

　　1.2.1  细胞增殖  采用MTT法,观察Fm04对K562细胞作用的量效与时效关系,接种指数生长期的K562细胞于96孔板上,分别设置空白组,Fm04组（1,2,4,8 μmol/L）,Cur组（5,10,20,40 μmol/L）。将培养板置于37 ℃、体积分数为0.05、饱和湿度的CO2培养箱培养至所需的时间,加入MTT溶液,继续培养4 h后,离心,弃上清,加入DMSO,颗粒完全溶解后用酶标仪在570 nm处测定每孔的光密度值(D)。

　　1.2.2  P210bcr/abl等信号蛋白表达  采用Western blot法,药物处理细胞24 h,收集细胞,以0.01 mol/L浴冷PBS(pH 7.2)洗2次,加入去污裂解缓冲液于4 ℃裂解30 min,离心,吸出上清,即为细胞总蛋白,用BCA蛋白定量,各组均采用同样的蛋白量上样,在SDS聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。电泳后转膜,封闭液封闭过夜,加一抗室温作用1 h,洗去未结合的一抗,以Western blot试剂盒加二抗,DAB染色。

　　1.2.3  Caspase3和Caspase9活性  药物处理细胞24 h,收集细胞,采用Caspase3、Caspase9分光光度法检测试剂盒,用分光光度计在λ=405 nm测定其D值。通过计算D诱导剂/D阴性对照的倍数来确定Caspase3和Caspase9活化程度。

　　2  结果

　　2.1  Fm04对K562细胞增殖的抑制  K562细胞增殖抑制率随Fm04浓度增大而提高,呈剂量依赖关系(图1A),其IC50为1.45 μmol/L,强度约为姜黄素的7倍;K562细胞增殖抑制率随着Fm04作用时间的延长而提高,呈时间依赖关系(图1B),且低浓度Fm04在12,24及48 h对K562细胞抑制率均比高浓度姜黄素高。

　　A:不同浓度Fm04和Cur; B:Fm04 4 μmol/L和Cur 10 μmol/L.

　　图1  Fm04对K562细胞增殖抑制的影响（略）

　　Fig 1  Inhibitory effect of Fm04 on proliferation of K562 cells福建医科大学学报  2008年5月  第42卷第3期李  娜等：姜黄素衍生物Fm04抑制K562细胞增殖及其对P210bcr/abl信号通路的影响

　　2.2  Fm04对K562细胞中P210bcr/abl及其下游信号通路蛋白的影响

　　2.2.1  Fm04下调K562细胞P210bcr/abl 蛋白含量  随Fm04剂量增大,P210bcr/abl蛋白条带灰度逐渐变淡,Fm04 1 μmol/L就可下调P210bcr/abl蛋白,Fm04 4 μmol/L最明显,条带基本消失,呈量效关系(图2A)。 Fm04 4 μmol/L作用12 h即对p210bcr/abl蛋白有抑制作用,随着时间的延长,条带逐渐变淡,至48 h,P210bcr/abl蛋白条带几乎消失，可见明显的时效关系(图2B)。

　　A:Fm04; B:4 μmol/L Fm04.

　　图2  Fm04对K562细胞P210bcr/abl蛋白含量的影响（略）

　　Fig 2  Effect of Fm04 on P210bcr/abl  in K562 cells

　　2.2.2  Fm04对K562细胞P210bcr/abl 下游相关信号通路蛋白含量的影响  分别以Fm04 1,2,4 μmol/L处理K562细胞12 h,随着剂量增加,NFκB蛋白逐渐减少;而以Fm04 1,2,4 μmol/L处理K562细胞24 h ,对于PAKT来说,随剂量增加,其蛋白含量减少;而对于PErk来说,其蛋白含量随剂量增加而增加(图3A)。用Fm04 4 μmol/L分别处理K562细胞1,3,6,12,24,48 h,PErk蛋白含量在1～6 h。随时间延长而减少,处理6 h蛋白基本消失,而12～48 h,蛋白含量随着时间延长而逐渐增加,此现象于姜黄素并未发生。Cur 40 μmol/L处理K562细胞,0～48 h内,PErk蛋白含量随时间变化逐渐减少(图3B)。

2.3  Fm04对线粒体凋亡途径的影响

　　2.3.1  Fm04触发K562细胞线粒体细胞色素C释放  Fm04 1,2,4 μmol/L处理K562细胞24 h能促进K562细胞线粒体细胞色素C释放,细胞质S100中的含量逐渐增加,相反,线粒体中的细胞色素C含量逐渐减少(图4)。

　　2.3.2  Fm04活化Caspase3、Caspase9  Fm04 1,2,4 μmol/L处理K562细胞24 h后,Caspase3、Caspase9的活化程度增高,能将偶联有发色基团的Caspase3序列特异性的多肽底物被剪切,发色基团游离出来,D值升高。

　　3  讨论

　　3.1  Fm04下调K562细胞P210bcr/abl 及其下游相关信号通路蛋白含量  本实验合成的姜黄素衍生物Fm04,化学结构经1HNMR和13CNMR确证。细胞增殖抑制实验表明，Fm04对K562细胞有明显的抑制作用,呈量效和时效关系,其抑制活性明显优于姜黄素。 P210bcr/abl是CML的特征性蛋白,具有异常活跃的酪氨酸激酶活性,是CML发病的主要原因,并与其对多种化疗药物耐药有关,且由于P210bcr/abl含有磷酸化位点,可与含SH2的信号分子相结合,从而活化下游相关的多条信号途径[49],促进细胞增殖。从实验结果表明,新合成姜黄素衍生物Fm04可下调K562细胞P210bcr/abl含量并呈量效和时效关系;Fm04还可下调与K562细胞增殖和凋亡有关的P210bcr/abl下游信号分子pErk(如6 h)、pAKT、NFκB。

　　A:不同剂量Fm04; B:不同时间Fm04及Cur.

　　图3  Fm04对K562细胞P210bcr/abl下游相关信号分子的影响（略）

　　Fig 3  Effect of Fm04 on the bcr/ablrelated signaling molecules  in K562 cells

　　图4  Fm04对K562细胞线粒体细胞色素C(CytC)的影响（略）

　　Fig 4  Effect of Fm04 on cytochrome C of mitochondria in K562 cells

　　图5  Fm04对K562细胞Caspase3和Caspase9活化程度的影响（略）

　　Fig 5  Effect of Fm04 on activation of Caspase3 and Caspase9 in K562 cells

　　3.2  Fm04对K562细胞PErk的影响  细胞外调节蛋白激酶(ERK)分为ERK1和ERK2,统称为ERK1/2,主要被各种生长因子、离子射线、过氧化氢等磷酸化而激活,进入细胞核作用于E1k1,cmyc,cfos,cjun,ATF,NFκB和AP1等转录因子,促进某些基因的转录与表达,和细胞的增殖与分化密切相关。本实验结果表明,Fm04作用K562细胞24h,pErk蛋白含量随Fm04剂量增大而增加(图3A),而细胞增殖实验结果显示(图1)Fm04对K562细胞的增殖有很强的抑制作用,通过观察不同时间点Fm04对pErk蛋白表达的影响发现,Fm04作用于K562,早期引起pErk减少,而晚期引起其增多,Chunrong等发现Sti571作用于bcr/abl阳性细胞也有类似状况[11]。有报道显示,细胞外信号调节激酶(ERK)1/2是Ca2+/CaM信号通路的重要调节因素[1213 ],许多Ca2+/CaM抑制剂均可引起(ERK)1/2的持续磷酸化并抑制细胞增殖。Shim合成研究的姜黄素衍生物HBC可通过引起HCT15细胞(ERK)1/2的持续磷酸化而阻断Ca2+/CaM信号通路而抑制细胞增殖[14],因此可推断Fm04除了P210bcr/abl信号通路,或许对Ca2+/CaM信号通路也有一定的抑制作用,该方面机制有待进一步研究。

　　3.3  Fm04对K562细胞Caspase3和Caspase9的影响  Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用,Caspase9是级联酶的上游分子,在正常状态下以酶原的形式存在于细胞浆中,没有活性,可被从线粒体向细胞质释放的细胞色素C激活。Caspase3在正常状态下以酶原的形式存在于细胞浆中,没有活性;但在细胞发生凋亡阶段,它被激活,活化的Caspase3由两个大亚基和两个小亚基组成,裂解相应的胞浆胞核底物,最终导致细胞凋亡。Fm04可促进细胞色素C从线粒体释放放入细胞质,活化Caspase9和Caspase3,激活下游的凋亡通路。

　笔者认为,新合成姜黄素衍生物Fm04可显著抑制K562细胞增殖并下调P210bcr/abl信号通路,具有显著的体外抗慢性粒细胞白血病活性,笔者将进行进一步的在体实验,为进一步改造开发高效低毒的抗肿瘤药物奠定基础。

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