青蒿琥酯诱导凋亡的U937细胞负载树突状细胞后的免疫应答

作者：郑智茵，王建峰，胡致平，沈建平，高瑞兰，叶宝东，林圣云，沈一平    作者单位：浙江省中医院血液科，杭州 310006

【摘要】  本研究探讨凋亡白血病细胞负载的树突状细胞（dendritic cells, DC）能否诱导特异性细胞毒T淋巴细胞反应。 用青蒿琥酯诱导U937细胞凋亡, 从正常人外周血单个核细胞诱生DC，将凋亡U937细胞负载DC, 并添加TNFα诱导DC成熟, 然后与自体T淋巴细胞共育,并联合 IL2以诱生细胞毒性T淋巴细胞（CTL）；应用流式细胞术分析DC和T细胞免疫表型, 采用DextranFITC内吞试验检测DC的抗原摄取能力；用ELISA法检测IL12p70的产生；采用MTT法检测凋亡U937细胞负载及未负载DC诱导的自体T淋巴细胞对不同的靶细胞（U937细胞和NB4细胞）的杀伤效应。结果表明：青蒿琥酯1 μg/ml作用于U937细胞48小时后, U937细胞的凋亡率达51.52%, DC在未成熟阶段时吞噬DextranFITC的能力最强，负载凋亡U937细胞之后并不能促使未成熟DC（iDC）分化为成熟DC（mDC）。凋亡U937细胞负载后的iDC在TNFα的作用下能够成为mDC。与未负载的mDC相比, 凋亡U937细胞负载后的mDC（mDCApoU937）分泌IL12p70水平明显增高, 而且由其所激发和扩增的T细胞以CD8+的T细胞为主。细胞毒性实验显示: mDCApoU937诱导的T细胞的对U937细胞的杀伤显著超过对NB4细胞的杀伤。结论： mDCApoU937能有效地诱导特异性抗白血病效应。

【关键词】  白血病

   Immune Response of Dendritic Cells Capturing Antigens from Apoptotic U937 Cells Induced by Artesunate

    ZHENG ZhiYin, WANG JianFeng1, HU ZhiPing, SHEN JianPing, GAO RuiLan2， YE BaoDong,  LIN ShenYun, SHEN YiPing, CHEN JunFa,  LUO XiouSU , ZHOU YuHong, YU RongXi

    Department of Hematology, Zhejiang Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou , 310006, China；1Department of Hematology, Hangzhon Munieipal Second People Hospital, Hangzhou China; 2Laboratory of Hematology, Zhejiang Provincial Hospital of Traditional Clinese Medicine, Hangzhou 310006, China

    Abstract    The objective of study was to investigate whether  U937 cellsloaded  dendritic cells (DCs)   could induce antileukemic immune activity.  The apoptosis of U937 cells was induced by artesunate(ART). DCs derived from peripheral blood mononuclear cells of health donors were loaded with apoptotic U937 cells, and induced to  maturation in the presence of TNFα. Matured DCs were cocultured with autologous Tlymphocytes, and combined with IL2 in order to induce the leukemiaspecific CTL. The phenotypes of DCs and T lymphocytes were tested by flow cytometry.  The ability of DC capturing antigens was measured by DextranFITC endocytosis. The IL12p70 level was assayed by ELISA kit. The proliferation of CTL and CTL activity were measured by MTT assay.  The results  showed that the apoptotic rate of the U937 cells   was 51.2%  when U937 cells were  induced by 1 μg/ml ART for 48 hours in vitro. DCs had the most powerful ability of endocytosis in its immature phase. Apoptotic U937 cells could not induce the  features of DC maturation, and  apoptotic U937 cellpulsed immature DCs could be matured with TNFα. The  IL12p70  level secreded by apoptotic U937 cellloaded mature DCs（mDCApoU937） was higher than  that of nonloaded  mDC. The proliferation of autologous T lymphocytes cocultured with mDCApoU937 was significantly remarkable and the content of CD8+ CTL was significantly higher in comparison with any other groups. CTL induced by mDCApoU937 had stronger   killing effect on U937 cells than NB4（p<0.01）. It is concluded  that the   mDCApoU937 can effectively generate T cellmediated

　　青蒿琥酯诱导凋亡的U937细胞负载树突细胞后的免疫应答    目前, 以树突状细胞（DC）为基础的免疫瘤苗已在淋巴瘤、黑色素瘤、肾癌等恶性肿瘤的临床治疗中获得明显疗效, 但针对急性白血病的治疗尚处于探索阶段。我们以健康正常人外周血单个核细胞来源的DC负载用中药青蒿琥酯诱导凋亡的U937细胞作为研究模型, 观察凋亡的U937细胞负载DC刺激自体T细胞转化为细胞毒T淋巴细胞（CTL）的能力, 探讨用凋亡的白血病细胞负载DC作为DC疫苗的可能性。

    材料和方法

    主要试剂

    正常人外周血白细胞层由浙江省中心血站提供；人单核细胞白血病细胞株U937由本院血液病研究所提供；人急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4由浙江大学肿瘤研究所提供；青蒿琥酯（artesunate, ART）为中国桂林第二制药厂产品；rhGMCSF购自厦门特宝生物股份有限公司；rhIL4和rhTNFα购自美国Pepro Tech 公司；rhIL2购自沈阳三生制药股份有限公司；DextranFITC（4 kD）购自美国Sigma公司；IL12p70 ELISA Kit购自法国Diaclone公司；PE/FITC标记的鼠抗人CD3、CD4、CD8单克隆抗体购自美国Becton Dickinson公司； CD80、CD83、CD86、HLADR等购自美国Pepro Tech公司；RPMI 1640培养液购自美国Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；Genomic DNA Miniprep Kit V.2购自上海申能博彩生物科技有限公司。

    U937细胞凋亡的诱导及检测

    按已报告的方法［1］, 取对数生长期的U937细胞, 调整浓度为1×105 /ml，加入ART的终浓度为0.25 、0.5、1、2   μg/ml, 置37℃、5% CO2 培养箱培养48小时, 离心收集细胞备用。 取1.5×106 U937细胞，按 Genomic DNA Miniprep Kit V.2试剂盒说明书提取DNA，2%琼脂糖凝胶电泳、紫外灯下摄片；同时，取1.5×106 U937细胞用70%乙醇固定、加RNase及碘化丙锭（PI）固定后，进行FCM（FACScan型,美国Bacton  Dickinson公司产品）检测，用Multicycle 2.50 DNA分析软件处理数据。

    DC的培养

    取1个单位的正常人外周血浓缩白细胞，经0.9%生理盐水一倍稀释后，用Ficoll密度梯度分离获得外周血单个核细胞（PBMNC），用完全培养液（CM）(RPMI 1640 培养液中含10 %的胎牛血请、100 U/ml青霉素G、100  μg/ml链霉素)，调整细胞浓度为3×106 /ml，置于10ml组织培养皿中，于37℃、5 % CO2条件下贴壁培养2小时后，吸出非贴壁细胞（淋巴细胞）放-80℃冻存备用。用CM轻洗培养皿1次后，加入含rhGMCSF 100 ng/ml和 rhIL4 20 ng/ml的CM，于37℃、5 % CO2条件下培养，第3天半量换液1次，培养7天，收集悬浮细胞，即为未成熟DC（iDC）；同样条件下，在培养的第6天添加rhTNFα 50 ng/ml，继续培养2天，收集悬浮细胞，即为成熟DC（mDC）。

    DC吞噬能力的测定

    分别提取iDC、mDC和非贴壁细胞（阴性对照），调整细胞浓度至2×105/ml，3种细胞各分为2组，即对照组和实验组, 2组均加入 DextranFITC 0.5 mg/ml，对照组置于4℃，实验组置于37℃，均孵育30分钟后，分别用PBS液洗涤4次，用FCM分析结果。

    凋亡的U937细胞负载DC

    DC培养的第6天，按凋亡的U937细胞:DC=1∶1加入，共同培养2小时后，分为2组: ①不加rhTNFα组; ②加入rhTNFα50 ng/ml组。2组分别继续培养2天后，①组DC称为iDCApoU937; 而②组DC称为mDCApoU937。

    DC分泌IL12p70的检测

    分别收集mDC和mDCApoU937的培养上清液，用ELISA法定量检测 IL12p70的含量，具体步骤根据试剂盒说明书进行。

    DC表型的分析

    分别取iDC、mDC、iDCApoU937、mDCApo组U937，用FCM检测各组DC膜表面CD80、CD83、CD86、HLADR分子的表达。

    凋亡U937细胞负载的DC激发自体T细胞增殖能力的检测

    按上述方法获取的自体淋巴细胞作为反应的T细胞（1×105/well）, 分别以mDCApoU937和mDC作为刺激细胞, 按T细胞与DC比率为10∶1和20∶1接种于96孔板（每组3个复孔），每孔液体（含IL2 100 U/ml的CM）总量为200 μl， 37℃、5% CO2条件下培养92小时，加入5 mmol/L MTT，20 μl/well，继续培养4小时；取出96孔板，水平离心5分钟，吸去上清液，加入MTT 助溶剂DMSO 200 μl/孔，充分溶解，用酶标仪于波长570 nm处读取A值。对照为IL2 100 U/ml培养的T细胞。

    凋亡U937细胞负载的DC激活肿瘤抗原特异性CTL细胞毒作用的检测

    分别取T细胞与DC比率为20∶1共培养4天诱导的T细胞为效应细胞，分3组： mDCApoU937诱导的T细胞组；未负载的mDC诱导的T细胞组； 单纯IL2 100  U/ml诱导的T细胞组。各组T细胞在与靶细胞混合培养之前各取一部分用于T细胞表型检测，即细胞洗涤、离心后分别加入CD3、CD4、CD8荧光抗体，用FCM检测。取对数生长期的 U937细胞和NB4细胞为靶细胞，按效靶比为20∶1比例，接种于96孔板，每组设3个复孔，于37℃、5% CO2条件下培养20小时，加入5 mmol/L MTT，20μl/孔，继续培养4小时，加入0.04 mmol/L酸化异丙醇200μl/L，15分钟后用酶标仪于波长570 nm处读取A值，计算杀伤率。

    细胞的杀伤率（%）=［（效应细胞孔的A值+单纯

    细胞孔的A值-细胞毒实验孔的A值）/单纯

    细胞孔的A值］×100%。

    统计学分析

    数据用±SD表示，组间比较采用t检验，应用SPSS  10.0软件分析实验结果。

    结    果

    U937细胞凋亡鉴定

    DNA凝胶电泳图显示：在0.5、1、2 μg/ml ART组可见典型的DNA 梯状条带（图1）。通过FCM测定细胞周期，与对照组相比，低于G1期细胞为凋亡细胞（Apo），其占细胞总数的数目为凋亡细胞比率（%）。U937细胞经ART作用48小时后，随着ART的浓度增加出现大量亚二倍体，从0.25-1 μg/ml的浓度，细胞凋亡率自21.07%上升到51.52%，但继续加大浓度为2  μg/ml后凋亡率下降为31.23%（图2）。选取1  μg/ml浓度ART诱导U937细胞后48小时为最佳剂量时间效应。 Figure 1.  DNA  electrophoresis pattern  after U937 cells incubated with various concentrations of artesunate  for 48 hours.    M: DNA marker. Lane 1-5: 0.25, 0.5, 1, 2 μg/ml and 0 μg/ml artesunate, respectively. Data are derived from  four different experiments.

   凋亡U937细胞负载对DC成熟的影响

    iDCApoU937，即负载凋亡的U937细胞后的iDC，膜表面分子CD80、CD83、CD86、HLADR的表达与未负载凋亡细胞的iDC相比无明显差异，在培养液中添加rhTNFα诱导iDCApoU937成为mDCApoU937后，DC成熟标记CD83和共刺激分子CD80、CD86的表达明显上调，但其表型与未负载凋亡细胞的mDC相比无显著差异（表1）。

    凋亡U937细胞负载前后DC分泌IL12p70的变化

    与培养第8天的mDC组上清液中 IL12的浓度相比, 抗原负载后的mDC ApoU937组 IL12的浓度明显增高（表1）。

    不同成熟阶段DC吞噬功能的变化

    在二维点阵图设门（R1）获取需分析的iDC、mDC和淋巴细胞群，以一维直方图显示分析结果见图3。分析表明： iDC对DextranFITC的摄取率为（92±6.81）%，当iDC在rhTNFα的作用下成为mDC后DextranFITC的内吞能力明显下降, 摄取率为（20±1.3）%（P﹤0.01，n = 4），阴性对照淋巴细胞的摄取率为（1.3±0.82）%，提示DextranFITC阳性的DC是吞噬了Dextran分子，而不是该分子粘着于细胞表面。

    凋亡U937细胞负载的DC对自体T细胞的激活作用

    MTT 比色法显示mDCApoU937对T细胞的激活作用最明显，A值最大（图4）。

    T细胞免疫表型分析

    检测结果见表2。由表2可见，与凋亡U937细胞未负载mDC诱导的T细胞和单纯用IL2诱导的T细胞相比，经mDCApoU937诱导的T细胞明显活化和增殖，表现为CD3分子的表达明显上调（p﹤0.05），而且增殖的T细胞以CD3+ CD8+细胞为显著（p﹤0.01）。

    凋亡U937细胞负载的DC诱导CTL对U937细胞杀伤活性测定

    mDCApoU937所激发和扩增的T细胞对U937细胞的杀伤率为（64.0±9.42）%, 对NB4细胞的杀伤率为（19.35±5.86）%（p﹤0.01），凋亡U937细胞未负载的mDC诱导的T细胞对U937细胞的杀伤率为（18.22±5.09）%，对NB4细胞的杀伤率为（18.52±6.45）%（p﹥0.05），提示经凋亡U937细胞负载的mDC诱导的T细胞对U937细胞具有较高特异性和高效的杀伤作用（表3）。

    讨    论

    T细胞只能识别经过抗原呈递细胞（APC）处理并与MHC分子结合的多肽来诱发免疫应答, 如果肿瘤抗原未被APC呈递就不能激发有效的抗肿瘤免疫。尽管白血病细胞可能表达与其异常染色体改变相关的白血病抗原, 然而白血病细胞表面MHCⅠ和（或）Ⅱ类分子、共刺激分子(CD80、CD86或CD40)及黏附分子(ICAM)的表达低下或缺乏导致抗原呈递的缺陷, 并且白血病细胞分泌的免疫抑制因子(IL10等)可抑制T细胞功能, 因此, 白血病患者体内通常不能产生有效的抗白血病性T细胞免疫。DC在免疫系统中是最有效的专职APC，能在体内激活童贞T细胞，从而激发初次免疫应答。利用DC的APC特性, 用肿瘤抗原冲击致敏DC制成DC瘤苗, 回输给肿瘤患者以消除其APC对肿瘤相关抗原呈递的缺陷, 激发肿瘤特异性T细胞免疫, 这一策略已在淋巴瘤、肾癌等恶性肿瘤的临床治疗中获得成功, 因而DC瘤苗的研究成为了目前肿瘤免疫治疗的热点。由于白血病相关抗原尚未确定, 我们试用凋亡的白血病细胞负载DC, 观察其能否诱导出抗白血病性免疫应答反应。

    我们采用已建立的体外DC培养体系诱导外周血中的单个核细胞分化为iDC和mDC［2］。已知DC分化发育过程中存在2个不同的阶段，iDC具有摄取、处理抗原的能力，当发育为mDC后其抗原捕获能力减退，取而代之的是获得了iDC所不具有的抗原呈递、活化T细胞的能力。iDC依靠大胞饮作用(macropincytosis)、受体介导的内吞和吞噬作用来捕获抗原。为测试培养的DC的抗原摄取能力，我们比较了iDC和mDC对DextranFITC的内吞能力，结果显示: iDC具有强大的吞噬DextranFITC颗粒的能力, 而mDC的吞噬能力明显低下，这提示培养的DC具有正常的抗原摄取能力，与文献报道相符。尽管不少文献报道，iDC在负载凋亡的肿瘤细胞之后能够促进DC成熟，但我们却发现，iDC负载凋亡的U937细胞之后未能使其转变为mDC。我们的结果与Jenne等［3，4］报道相同。Jenne解释其原因为，iDC负载凋亡肿瘤细胞后，培养液中内源性TNFα含量的低下不足以使iDC分化成熟。因为只有mDC能有效地呈递抗原，引发免疫应答。我们在负载凋亡U937细胞的iDC培养液里添加TNFα后发现，外源性的TNFα能够诱导负载凋亡细胞抗原的iDC发育成熟，表现为mDCApoU937的表型与mDC相同。

    新近的研究发现，iDC通过αvβ5和CD36介导对凋亡细胞的吞噬［5］，使凋亡细胞所携带的外源性抗原能被DC的MHCⅠ类分子所呈递［5，6］。不少实验显示：与肿瘤特异性抗原肽、肿瘤细胞裂解物负载DC的方法相比，采用整个凋亡的肿瘤细胞负载DC，可同时通过MHCⅡ类分子及MHCⅠ类分子呈递多种已知及未知的肿瘤抗原—交叉呈递，能更有效地全面启动抗肿瘤免疫［7-10］。诱导细胞凋亡的方法很多，可以是抗肿瘤药物、放射线照射、病毒感染等［11］。ART是中药青蒿素的衍生物，近年来的研究表明，青蒿素类药物不仅是一种抗疟药物，而且能诱导肿瘤细胞凋亡，具有一定的抗肿瘤作用［12，13］。我们以前的实验已证实，ART在体外能够诱导U937细胞凋亡［1］，目前我们首次应用由ART诱导凋亡的U937细胞负载和致敏DC，从测定培养上清IL12p70的浓度、T细胞免疫表型及细胞毒性实验的结果显示: mDCApoU937组的IL12p70分泌量明显比未负载的mDC组增加, 与其所诱导的T细胞显著活化和增殖的结果相吻合, 而且与未负载的mDC及单用IL2诱导的T细胞组相比，mDCApoU937所诱导的T细胞以CD8+为主, 对U937细胞具有明显的溶细胞效应，而对NB4细胞的杀伤作用与其他对照组诱导的T细胞相似。与此同时我们发现，mDCApoU937诱导的CD4+T细胞的比率与单用IL2组的CD4+T细胞相比亦有所增加，尽管无统计学意义，但我们的结果说明，DC能够摄取和处理由ART诱导凋亡的U937细胞中的白血病抗原，通过MHC类分子呈递给T细胞, 诱导产生针对U937细胞的特异性细胞毒性效应。

    鉴于大多数急性白血病未能发现其特异性抗原，用凋亡的白血病细胞, 即全细胞抗原负载和致敏DC, 用以激发有效的抗白血病免疫, 有望成为对急性白血病患者体内微小残余病灶具有特异性免疫治疗作用的一种DC瘤苗。

【参考文献】1王建峰，陈燕，虞荣喜. 青蒿琥酯诱导白血病细胞凋亡及机理的实验研究. 浙江中医学院学报，2005; 29:55-58

2Zheng Z, Takahashi M, Narita M, et al. Generation of dendritic cells from adherent cells of cord blood by culture with granulocytemacrophage colony stimulating tactor, interleukin4 and tumor necrosis factoralpha. J Hematother Stem Cell Res, 2000; 9:453-464

3Jenne L, Arrighi JF, Jonuleit H, et al. Dendritic cells containing apoptotic melanoma cells prime human CD8+ T cells for efficient tumor cell lysis. Cancer Res, 2000; 60:4446-4452

4Kotera Y, Shimizu K, Mule JJ. Comparative analysis of necrotic and apoptotic tumor cells as a source of antigen(s) in dendritic cellbased immunization. Cancer Res, 2001; 61:8105-8109

5Albert ML, Pearce SF, Francisco LM, et al. Immature dendritic cells phagocytose apoptotic cells via αvβ5 and CD36, and crosspresent antigens to cytotoxic T lymphocytes. J Exp Med, 1998; 188:1359-1368

6Albert ML, Sauter B, Bhardwaj N. Dendritic cells acquire antigen from apoptotic cells and induce class Irestricted CTLs. Nature, 1998; 392(6671):86-89

7Labarriere N, Bretaudeau L, Gervois N, et al. Apoptotic bodyloaded dendritic cells efficiently crossprime cytotoxic T lymphocytes specific for NA17A antigen but not for MelanA/MART1 antigen. Int J Cancer, 2002; 101:280-286

8Hoffmann TK, Meidenbauer N, Dworacki G, et al. Generation of tumorspecific T lymphocytes by crosspriming with human dendritic cells ingesting apoptotic cells. Cancer Res, 2000; 60:3542-3549

9ShaifMuthana M, McIntrye C, SisIey K, et al. Dead or alive: immunogenicity of human melanoma cells when presented by dendritic cells. Cancer Res, 2000; 60:6441-6447

10GaleaLauri J, Darling D, Mufti G, et al. Eliciting cytotoxic T lymphocytes against myeloid leukemiaderived antigens: evaluation of dendritic cellleukemia cell hybrids and other antigenloading strategies for dendritic cellbased vaccination. Cancer Immunol Immunother, 2002; 51:299-310

11徐克. 细胞凋亡诱导的研究进展. 中国实验血液学杂志，1997; 5：37-39

12Efferth T, Sauerbrey A, Olbrich A. Molecular modes of action of artesunate in tumor cell lines. Mol Pharmcol, 2003; 64:382-394

13Posner GH, Paik IH, Sur S, et al. Orally active, antimalarial, anticancer, artemisininderived trioxane dimers with high stability and efficacy. J Med Chem, 2003; 46:1060-1065