GPI锚定修饰的慢粒白血病bcr/abl和鼠IL12真核双表达质粒的构建及表

作者:陶崑,王东,曾建明,黄世峰

   【摘要】  目的： 构建由糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定修饰的bcr/abl和鼠IL12（mIL12）真核双表达质粒，在COS7细胞中检测其基因和膜蛋白表达. 方法： 以含有慢粒白血病（b3a2型）migP210全长序列的质粒为模板，通过PCR扩增获得654 bp的bcr/abl融合基因片段，酶切后插入pBudCE4.1空载中，经鉴定获得重组质粒pBB. 同时，RTPCR扩增人外周血淋巴细胞CD24分子中的GPI锚定序列，酶切后克隆入pBB质粒中与bcr/abl基因片断羧基端相连，获得重组质粒pBBG并鉴定. 然后扩增mIL12基因片段并亚克隆入pBBG另一多克隆位点，构建重组质粒pBBGI. 在多聚阳离子介导下将pBBGI质粒转染COS7细胞，采用RTPCR, Western Blot检测bcr/abl融合基因及其蛋白的表达，ELISA检测mIL12的表达. 结果： 经酶切和测序鉴定证实，由GPI锚定连接的bcr/abl及mIL12基因插入片段正确；转染细胞中有bcr/abl融合基因、转染细胞膜上有bcr/abl融合蛋白的表达，细胞培养上清中也有mIL12的表达. 结论： 成功构建能在真核细胞中表达bcr/abl和mIL12的重组质粒PBBGI，为进一步研究bcr/abl基因疫苗诱导肿瘤特异性细胞免疫奠定了基础.

【关键词】  bcr/abl融合基因；糖基磷脂酰肌醇类；白细胞介素12；真核双表达

      0引言

    　　慢性粒细胞白血病(CML)的细胞遗传学特征是具有Ph染色体，即t(9；22)(q34．1；q11．2)，形成bcr/abl融合基因并表达具有强烈酪氨酸激酶活性的bcr/abl融合蛋白，后者使造血干细胞异常转化而导致CML发生. p210融合蛋白属于肿瘤特异性抗原，其抗原性由bcr/abl基因的融合区域决定. 然而，bcr/abl融合蛋白是CML细胞的胞内蛋白，如何将其有效递呈到CML细胞膜表面从而持续诱导特异性细胞免疫并成为效应CTL细胞的靶向分子，一直是国内外研究的热点. 人外周血淋巴细胞表面CD24分子中含有一种特定的GPI锚定序列，它能通过其糖基化磷脂酰肌醇结构将重组蛋白锚定于细胞膜上［1-2］. 而IL12是目前最强的诱导细胞免疫活性和调节作用的细胞因子［3］. 本研究旨在构建一种真核双表达质粒使bcr/abl融合蛋白通过GPI的锚定修饰作用表达于细胞膜上而持续刺激机体产生免疫应答，同时利用mIL12增强细胞免疫效应，为下一步应用该核酸疫苗诱导肿瘤特异性免疫应答奠定基础.

    1材料和方法

    1.1材料真核双表达载体pBudCE4.1购自Invitrogen公司；含有编码慢粒白血病bcr/abl融合蛋白全长序列（b3a2型）的migP210质粒为本室保存；小鼠单链IL12质粒(Elasti)由本室曾建明博士赠送；COS7细胞由重庆医科大学感染性疾病分子生物学实验室赠送. 质粒抽提纯化、胶回收、PCR产物纯化试剂盒购自上海华舜生物公司；限制性内切酶、cDNA逆转录试剂盒、快速连接试剂盒、Primstar酶及其他PCR试剂购自TaKaRa公司；RNA提取试剂、琼脂糖等购自上海生工生物工程公司；RPMI1640和胎牛血清购自杭州四季青生物技术公司；DAB显色试剂盒和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自Santa Cruz生物技术有限公司；NC膜购自北方同正生物技术发展公司；膜蛋白提取试剂盒为南京凯基生物技术有限公司产品；转染试剂jetpEITM为POLYplus transfection公司产品；小鼠IL12 P70ELISA检测试剂盒为美国R&D公司产品.

    1.2方法

    1.2.1pBudCE4.1bcr/abl重组质粒的构建及鉴定根据登录GenBank Granulysin编码序列NM005157，设计引物扩增bcr/abl 融合基因片段，约654 bp. 上游引物P1： 5′GCAAGCTTACCATGGACATCCGTGG3′；下游引物P2： 5′GTCGACCTTGCCATCAGAAGC3′. 引物由上海生工生物工程公司合成. 以含有编码bcr/abl融合蛋白全长序列的migP210质粒为模板，进行PCR扩增. 反应体系如下：模板1.5 μL, 5×缓冲液6 μL, dNTP 2.4 μL，P1, P2各2  μL，Primstar酶0.3 μL，灭菌去离子水15.8 μL，共30 μL. 扩增条件：94℃ 5 min；98℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃ 55 s，共32个循环；72℃ 5 min. PCR产物用12 g/L琼脂糖凝胶电泳检测. HindⅢ/SalⅠ双酶切PCR产物和空载体pBudCE4.1,并回收片段. 然后将bcr/abl融合基因片段定向克隆入空载体中，构建重组质粒pBudCE4.1bcr/abl，命名为PBB. 将PBB质粒转化感受态大肠杆菌DH5α，再用含40 mg/L Zeocin抗菌素的低盐LB培养基进行菌落筛选. 抽提PBB质粒进行PCR及酶切鉴定，并送TaKaRa生物技术公司测序.

 1.2.2pBudCE4.1bcr/ablGPI重组质粒的构建及鉴定根据登录GenBank Granulysin编码序列X69397,设计并合成引物扩增人外周血淋巴细胞CD24分子中的糖基化磷脂酰肌醇锚定基序(GPI)，约243 bp. 上游引物P3： 5′GTCGACATGGGCAGAGCAAT3′；下游引物P4： 5′GGATCCTTAAGAGTAGAGATGCAGAA3′. 抽取人外周血5 mL，Ficoll液分离出淋巴细胞，提取总RNA进行逆转录，并以逆转录cDNA为模板，P3, P4为引物进行PCR扩增，扩增产物用15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测. SalⅠ/BamHⅠ双酶切RTPCR产物和重组质粒PBB，并回收. 经连接、转化及Zeocin抗生素筛选，再通过PCR及酶切、测序鉴定后，命名为PBBG.

    1.2.3pBudCE4.1bcr/ablGPImIL12重组质粒的构建及鉴定以鼠单链IL12质粒为模板,设计引物用于扩增mIL12基因片段，约1625 bp. 上游引物P5： 5′GCGCGGCCGCACCATGGGTCAATCACGCTAC3′，下游引物P6： 5′AGATCTCTAGGATCGGACCCTGCAGG3′. PCR反应体系为： 模板1 μL,5×缓冲液4 μL, dNTP 1.6 μL, P5, P6各2 μL ，Primstar酶0.3 μL ，灭菌去离子水9.1 μL ，共20 μL. 扩增条件：94℃   10 min；98℃   10 s，60℃  15 s，72℃  90 s，共32个循环；72℃ 8 min. PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测. BglⅡ/NotⅠ双酶切PCR产物和PBBG质粒，经连接转化筛选，再通过酶切、测序鉴定后命名为PBBGI.

    1.2.4抗血清制备与收集PBBG重组质粒免疫BALB/c小鼠，接种时PBBG质粒（100 μg）与7.5 g/L的步比卡因以1∶4的体积比混合，多点注射小鼠后大腿肌肉，每隔10 d注射1次，共计3次. 末次免疫后30 d，摘取小鼠眼球，收集血液、分离血清，-20℃保存备用.

    1.2.5细胞转染将真核表达细胞cos7接种于含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养基中，待生长至80％汇合，将重组质粒PBB, PBBG, PBBGI进行转染，并以空载体pBudCE4.1转染作为对照. 转染试剂为多聚阳离子转染试剂jetpEITM，具体方法参照试剂说明书进行.

    1.2.6RTPCR检测转染细胞的基因表达分别于转染后24 h收集各组细胞，提取总RNA进行逆转录，并以各自cDNA为模板，分别以bcr/abl, GPI, mIL12的特异引物按照上述条件进行PCR扩增.

    1.2.7WesternBlot检测转染细胞膜蛋白表达分别于转染后72 h收集各组细胞提取膜蛋白，进行SDSPAGE电泳. 硝酸纤维素膜（NC膜）于半干式电转印仪中15V转印8 min后，放入Tris缓冲液（TBS）中漂洗，封闭过夜. 然后加入免疫小鼠特异抗血清（1∶125），4℃结合8 h，漂洗后与HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶400) 37℃结合1 h, TBS洗3次. DAB显色5 min，将NC膜移入含PBS的平皿中终止反应.

    1.2.8ELISA检测mIL12的表达根据ELISA试剂盒操作说明，于转染后72 h取100 μL  PBBGI质粒转染组细胞培养上清进行检测，同时以pBudCE4.1空载体和未转染的COS7细胞培养上清作对照，每组均做复孔. 绘制标准曲线，根据标准曲线计算出实际含量.

    2结果

    2.1bcr/abl融合基因片断的PCR扩增与鉴定以migP210质粒为模板，经PCR扩增得到bcr/abl融合基因片段，约654 bp. 用HindⅢ和SalⅠ双酶切PBB质粒．可切下约654 bp的目的条带(图1). PBB测序结果经与GenBank上的编码序列比对后，显示此克隆的碱基序列正确.

    M: DNA marker ( D503A ); 1: 经HindⅢ/SalⅠ酶切的PBB.

    图1PBB酶切鉴定

    2.2GPI 锚定序列的RTPCR扩增与鉴定分离人外周血淋巴细胞，通过RTPCR扩增，获得约243 bp大小的GPI锚定序列. 经SalⅠ/BamHⅠ双酶切重组质粒PBBG，可切下相同大小的目的条带(图2A). 测序结果表明基因未发生突变，其序列与GenBank报道相符. 同时，我们用HindⅢ/ BamHⅠ双酶切PBBG,得到约897 bp大小的片断，说明经SalⅠ酶切位点连接，PBBG质粒中的GPI锚定序列已与bcr/abl融合基因片断下游羧基端相连，实现了我们的锚定要求(图2B).2.3mIL12基因片段的PCR扩增与鉴定PCR扩增单链mIL12质粒,得到1625 bp大小的mIL12基因片段(图3). 采用BglⅡ/NotⅠ双酶切重组质粒PBBGI，可切下相同大小的目的条带(图4). 双向测序结果表明，mIL12序列有一处碱基突变，从ATG开始，第480位的t变为c(对应的氨基酸无改变).

    2.4RTPCR检测转染细胞的基因表达转染细胞24 h后提取总RNA，通过RTPCR,  PBB质粒转染组扩增出654 bp大小的bcr/abl融合基因片段，PBBG质粒组也扩出243 bp的GPI锚定序列和654 bp的bcr/abl片段,PBBGI质粒组则分别扩出243 bp, 654 bp和1625 bp的mIL12目的条带，而pBudCE4.1空质粒转染组未扩出相应条带(图5).

    2.5WesternBlot检测转染细胞膜蛋白表达转染72 h后提取细胞膜蛋白，经WesternBlot检测显示，PBBG和PBBGI质粒转染组有明显的Mr 20 000大小的bcr/abl融合蛋白表达，而PBB质粒组细胞膜上bcr/abl融合蛋白表达较弱，pBudCE4.1空载体组则未表达；4组转染细胞膜上均有Mr 55 000的内参α微管蛋白表达(图6).

    2.6ELISA检测mlL12的分泌表达取PBBGI 质粒转染组72 h的细胞培养上清，用ELISA试剂盒检测到mIL12表达，含量为164.75  pg/L，pBudCE4.1空载体转染组和未转染的COS细胞培养上清均未检出mIL12.

    3讨论

    　　CML具有特征性的bcr/abl融合基因，依据bcr断裂点位置不同，主要存在b3a2和b2a2两种基因拼接形式. b3a2型融合基因可编码产生Mr为210 000的P210融合蛋白，该蛋白具有异常增强的酪氨酸激酶活性，与细胞恶性转化与克隆密切相关. p210的抗原性限定在bcr/abl融合位点内，这段氨基酸序列在正常细胞中不存在，因此该序列可作为肿瘤特异性抗原，这为CML的免疫治疗提供了依据. CTL在CML特异性免疫治疗中发挥着重要作用［4-5］. T淋巴细胞不能识别可溶性天然抗原，而只能识别经过加工并与MHCⅠ类分子结合递呈到细胞表面的抗原片段. 然而，P210融合蛋白为胞内蛋白，其免疫原性主要在胞内，虽然极少数bcr/abl融合多肽含有与MHCⅠ类分子结合的氨基酸序列，但仅与其中HLAA3, A11, B7有较好的亲和力［6］，不能持续呈递于细胞膜上而刺激产生持久有效的抗白血病免疫反应；同时，体外CTL水平检测也需要能在细胞膜上表达肿瘤抗原表位的特异性靶细胞作为实验工具，因此，诱导bcr/abl融合蛋白由细胞内转到细胞膜上表达十分重要.

    　　糖基化磷脂酰肌醇(GPI)是一种脂性结构，蛋白质可通过该结构锚定于真核细胞膜表面而形成锚定蛋白. 细胞中存在多种锚定蛋白，如CD14，CD24，CD48，CD52等，它们与传统的跨膜型表面蛋白不同，不跨越细胞膜脂质双层，只通过其羧基末端的GPI结构锚定于细胞膜上，在免疫识别、跨膜信号转导及诱导细胞产生应答等方面起着重要作用［1-2］. 当GPI锚定信号肽与目的基因羧基端连接构成嵌合性cDNA并装到合适的真核表达载体后，可转染真核细胞，并能筛选出高表达的锚定蛋白细胞株［7］. 本研究中，我们将人外周血淋巴细胞表面CD24分子中的GPI锚定序列通过RTPCR扩增出来，经SalⅠ酶切位点连接到bcr/abl融合基因下游羧基端，构建重组质粒PBBG，并转染真核细胞，通过RTPCR和Western Blot鉴定，GPI锚定修饰的PBBG确实在cos7细胞中有bcr/abl融合基因，在细胞膜上有bcr/abl融合蛋白的表达，其表达水平明显高于未用GPI连接的PBB质粒，说明GPI的锚定修饰作用能够实现bcr/abl融合蛋白的膜上表达. 而IL12作为一种细胞免疫调节因子，在促进IFNγ，IL2等细胞因子产生、介导细胞免疫并增强CTL的细胞毒活性方面有重要作用［3］. 因此，我们又将mIL12基因片段克隆入PBBG质粒的另一多克隆位点，构建重组质粒PBBGI，以期利用细胞因子本身的生物学活性及其佐剂作用优化宿主特异性免疫反应. 实验结果表明该质粒转染组的细胞培养上清中有mIL12表达.

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