一例HLAA新等位基因A*2459的测序分析

作者：章伟，何俊俊，吕沁风，王炜，韩浙东，朱发明，严力行    作者单位：浙江省血液中心，卫生部血液安全研究重点实验室，杭州 310006

【摘要】  本研究探讨HLA新等位基因HLAA*2459的分子机制。样本DNA抽提采用PELFREEZ抽提试剂盒，利用单链特异性引物PCR方法扩增先证者HLAA基因的第2-4外显子，PCR产物直接进行第2、3、4外显子双向测序分析。结果显示:先证者样本中存在2个HLAA等位基因，其中1个等位基因为HLAA*1101，另1个经Blast验证其为新的等位基因，新的等位基因序列已递交GenBank（DQ313255,DQ313256,DQ313257）。与最接近的HLAA*24020101等位基因序列相比，新的等位基因仅在第3外显子上有1个核苷酸不同，即第527位T→C；这导致氨基酸第152位Val→Ala。结论：该等位基因为新的HLAA等位基因，被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLAA*2459。

【关键词】  等位基因

    Sequence Analysis of A Novel HLAA*2459 Allele

    ZHANG Wei, HE JunJun, L  QinFeng, WANG Wei, HANG ZheDong, ZHU FaMing,

    YAN LiXing

    Blood Center of Zhejiang Province, Key Laboratory of Blood Safety Research of Ministry of Health, Hangzhou 310006, China

    Abstract    This study was aimed to investigate the molecular genetics basis of a  novel allele HLAA*2459 in Chinese population. DNA was extracted from whole blood by PELFREEZ DNA extraction kit. The amplification of HLAA exons 2-4 of the proband was preformed by allele specific primer PCR and the amplified product was sequenced bidirectionally with primers. The sequencing results showed HLAA alleles of the proband as A*1101 and the novel allele. The sequences of the novel allele have been submitted to GenBank（DQ313255,DQ313256,DQ313257）. After Blast HLA analysis, the novel allele showed only one nucleotide differences with HLAA*24020101 at nucleotide position 527 T to C in exon 3. This results in an amino acid changes from Val to Ala at codon 152. In conclusion, this allele is a novel one and has been officially named HLAA*2459 by the WHO Nomenclature Committee.

    Key words    HLAA；allele;sequencing

    J Exp Hematol 2007; 15(5):1090-1092

    人类白细胞抗原（HLA）复合体定位于6号染色体的短臂上，包括多个基因座位，是目前所知最富多态性的系统，每一个座位上有多个等位基因。HLAA属于HLAⅠ类分子，现发现的HLA－A等位基因已超过451个［1,2］。我们实验室新近确认了1个新的等位基因HLAA*2459，该样本在聚合酶链反应－序列特异性寡核苷酸探针（PCRSSO）方法常规检测中HLAA座位被指定为HLAA*2448N和HLAA*11XX。由于HLAA*2448N是不表达等位基因，在人群中十分罕见，为了进一步确认其结果，我们对样本进行了测序分析，结果证实为1个新的HLAA等位基因，现报告如下。

    材料和方法

    样本来源

    先证者为男性，浙江籍汉族，为造血干细胞捐献者，在本实验室HLA常规分型中因出现罕见位点而进一步确认。

    样本DNA提取

    采用PELFREEZ DNA抽提试剂盒，严格按试剂说明进行操作。

    样本HLA分型

    HLAA、B、DRB1基因分型采用PCRSSO方法（Tepnel Lifecodes,Stamford, CT），严格按试剂说明书进行操作， 结果分析为自动软件判读。 HLAA、B血清学分型采用Invitrogen公司的HLAAB血清分型板，按试剂盒操作说明书进行反应。

    基金项目：浙江省医药卫生科学研究基金，编号2003Z003

    通讯作者：严力行,教授,硕士生导师. 电话：（0571）85167801.

    Email: ylx@zjb.org.cn

    2006-08-14 收稿；2007-05-08 接受

    HLAA基因2-4外显子测序分析

    PCR扩增  引物参照Dormoy等［3］的报道，由上海申能博彩公司合成（附表）。扩增反应体系总体积为100   μl，其中含10×PCR缓冲液10 μl，样本DNA 200-400 ng，LA TaqDNA聚合酶4.0 U；dNTP、MgCl2终浓度分别为0.2 mmol/L、1.25 mmol/L，引物终浓度为0.3 μmol/L。用ABI公司的9700型PCR自动扩增仪扩增，扩增条件为96℃预变性1分钟，96℃ 25秒，64℃ 45秒，72℃ 2分钟，22个循环；96℃ 25秒，62℃ 45秒，72℃ 2分钟，13个循环，72℃延伸10分钟后冷却至4℃。

    中国实验血液学杂志  J Exp Hematol 2007; 15(5)一例HLAA新等位基因A*2459的测序分析Table. Information of amplification and sequencing primers

    NameSequenceUsageVal G15TGGCGCCCCGAACCCTCGHLAA*24 specific forward primerLeu C15CGCCCCGAACCCTCCTCHLAA*11 specific forward primerP3 Intron 6ACCCACAGAASATGTGGCTAGHLAA reverse primerP3 Intron 2AGCCCGTCCGTGGGGGATGA Sequence primerP3 Intron 3AGTCCCAAWTGTCTCCCCTCCTT Sequence primerP5 Intron 2RCSTTWACCCGGTTTCATTTTC Sequence primerP5 Intron 3AGGTGTSCTGTCCATTCTCAAGSequence primerP3 Intron 2AGCCCGTCCGTGGGGGATGA Sequence primer

    序列分析  PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶上电泳45分钟，紫外透射仪下显示扩增成功后，从凝胶上切取目的DNA片段，用QIAquick Gel Extraction Kit(德国Qiagen公司产品)试剂盒纯化回收DNA片段。将回收纯化的扩增片段按Big Dye Sequencing Kit(ABI公司产品)试剂盒操作进行测序反应，测序引物除PCR反向扩增引物外，其它测序引物见附表。采用乙醇/醋酸钠（终浓度分别为66%和0.083 mol/L）法纯化测序PCR产物。纯化产物经热变性速冷上ABI PRISM 377测序仪进行PAGE电泳，Sequence Analysis和MT Navigator软件进行数据分析。

    结    果

    PCRSSO基因分型结果

    先证者样本第1次采用PCRSSO检测后，HLAA,B和DRB1位点经软件自动指定为HLAA*11XX, 2448N;HLAB*4001,；HLADRB1*04XX，1602。其中HLAA*2448N是不表达等位基因，十分罕见。为了验证PCRSSO方法的结果，对样本进行测序分析。

    先证者HLAA基因2-4外显子序列分析

    采用HLAA*11和HLAA*24特异性引物分别进行PCR扩增，PCR产物直接测序分析后发现，其中1个HLAA等位基因为HLAA*1101；另1个等位基因经Blast HLA验证其为新的等位基因。新的等位基因序列已递交GenBank（DQ313255,DQ313256,DQ313257）。经Blast验证与最接近的A*24020101等位基因序列相比，新的等位基因仅在第3外显子上有1个核苷酸不同，即第527位T→C，这导致氨基酸第152位Val→Ala（附图）。该等位基因为新的HLAA等位基因，被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLAA*2459。

    Figure. Result of partial sequencing of HLAA*2459  allele.     The  position 527 is C.

    血清学分型结果

    先证者样本血清板反应格局为1D,1E,4D孔阳性，参照判断表格其血清学特异性可清楚指定为HLAA11,24;HLAB60。

    讨    论

    HLA系统具有高度遗传多态性，主要表现在不同人群HLA分布特点的差异以及在同一HLA基因座位有多种不同的等位基因。HLA座位上不同等位基因的区别主要在于高度多态性位点的碱基不同，多态性位点常位于2号和3号外显子，少数在1号和4号外显子。随着HLA分型技术的发展，目前HLA的等位基因数量已超过2240个，现仍在不断发现新的HLA等位基因［4-6］。新的等位基因在常规的DNA分型方法（PCRSSP、PCRSSO）中可能出现一些模棱两可的分型结果，表现为依照试剂分型格局判断可能出现多条带或少条带、探针的多余或缺少、不同方法结果的不一致、Bw4或Bw6关联不一致、罕见位点等，这在常规的分型工作中应引起重视，避免分型结果错误。

    我们实验室以前报道了在中国汉族人群中发现HLAB和DRB1新的等位基因［4-6］。本实验中我们在造血干细胞捐献者中发现了新的HLAA等位基因，该样本常规分型中因出现罕见位点HLAA*2448N而进行深入分析。HLAA*2448N为白种人群首次报道的等位基因，目前全球范围内仅报道1例。为了验证PCRSSO结果，我们对样本进行测序分析，结果显示样本为新的等位基因，这种PCRSSO方法指定为罕见等位基因而实际上是新位点的情形在分型中应引起重视。HLAA24在东方人群中比较常见，现共检测出65个与A*24相关的等位基因，本例为检出的第66个A*24等位基因，通过血清学实验证实HLAA*2459相应的血清学特异性为HLAA24。HLA A*2459等位基因与HLAA*24020101序列相比，第2和4外显子上完全相同，仅在第3外显子第527位有1个核苷酸的差异，这个变异可导致氨基酸的改变。已证实HLA类基因的第2、3、4外显子分别编码α链的α1、α2、α3结构域，其中α1、α2两个结构域位于HLAⅠ类分子的顶部，共同组成抗原肽结合区，是分子的可变区和抗原性多肽识别的部位。HLAA*2459与HLAA*24020101相比，α2结构域有氨基酸的改变，这种改变对HLA蛋白质分子结构和抗原肽结合的影响仍有待于进一步研究。分析IMGT/HLA序列数据库可发现HLAA基因第527位是多态性位点，可表现位C、T、G、A。现证实的HLAA*24等位基因在此位置大多数为T,仅HLAA*2418和HLAA*2456为A,而HLAA*2459为C。

【参考文献】1Marsh SG, Albert ED, Bodmer WF, et al. Nomenclature for factors of the HLA system, 2004. Tissue Antigens, 2005;65: 301-369

2Robinson J, Waller MJ, Parham P, et al. IMGT/HLA and IMGT/MHC: sequence databases for the study of the major histocompatibility complex. Nucleic Acids Res, 2003;31:311-314

3Dormoy A, Froelich N, Leisenbach R, et al. Monoallelic amplification of exons 2–4 using allele group specific primers for sequencebased typing (SBT) of the HLAA, B and C genes: preparation and validation of readytouse preSBT minikits. Tissue Antigens, 2003; 62:201-216

4Yan LX, Zhu FM, L QF, et al. Identification of HLAB*5136 in the Chinese population. Tissue Antigens,2005; 65:280-282

5Yan LX, Zhu FM, L QF, et al. Identification of a new HLADRB1 allele,HLADRB1*1212 and comfirmation of HLAB*1586. Tissue Antigens,2005; 65: 582-583

6朱发明，吕沁风，章伟等. 一例新的HLAB等位基因B*5614的核苷酸序列分析.中华医学遗传学杂志，2005；22：288-290