急性白血病病人白血病细胞Survivin基因的表达及其临床意义

作者：刘建刚作者单位：青岛大学医学院血液学教研室,山东 青岛 266021 【摘要】  目的 观察Survivin基因在急性白血病（AL）病人白血病细胞中的表达,并分析其与预后关系。方法应用RTPCR方法检测62例不同时期AL病人白血病细胞Survivin mRNA的表达情况，以10例健康人作为对照。结果 62例AL病人白血病细胞Survivin mRNA阳性表达率为72.58%。ALL细胞Survivin mRNA阳性表达率(76.5%)与ANLL细胞(71.1%)比较差异无显著性，二者均高于正常对照组(χ2=6.01、7.02,P<0.05)。初治和复发AL病人白血病细胞Survivin mRNA阳性表达率分别为78.95%、85.71%，明显高于对照组(χ2=12.77、9.77，P<0.05)。白血病细胞Survivin mRNA表达阴性者接受1个疗程化疗后骨髓缓解率（BMR）为77.78%,明显高于阳性表达者的 31.03%（χ2=4.39,P<0.05）。结论 Survivin基因表达在白血病细胞的增殖分化和(或)抗凋亡过程中发挥了重要作用,可能是导致AL细胞对化疗药物不敏感的原因之一，Survivin基因可作为靶向白血病治疗的一个潜在靶点。 【关键词】  Survivin基因 白血病 聚合酶链反应    CLINICAL SIGNIFICANCE OF SURVIVIN EXPRESSION IN ACUTE LEUKEMIC CELLSLIU JIANGANG, GUAN HONGZAI, LU WEI  (Department of Hematology, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China) ［ABSTRACT］ObjectiveTo explore the correlation between the expression of Survivin gene in acute leukemic cells and its clinical significance. MethodsSurvivin gene expression in 62 acute leukemic patients, and 10 healthy adult controls were studied using semiquantiative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RTPCR) technique. ResultsThe positive expression rate of Survivin gene in the patients was 72.58%. There was no significant difference in Survivin gene expression between ALL cells (76.5%) and ANLL cells (71.1%), but both ALL and ANLL cells were higher than that in normal bone marrow cells (χ2 =6.01,7.02;P<0.05). The Survivin gene expression levels of initially treated patients (78.95%) and recurrent  (85.71%) were significantly higher than that in normal bone marrow cells (χ2 = 20.16, P<0.05).The bone marrow remission rate of patients with negative Survivin mRNA expression was higher than those with positive expression after one course of chemotherapy (77.78% vs 31.03%) ( χ2 =4.39,P<0.05).ConclusionThe important role of Survivin gene expression in the proliferation and differentiation of acute leukemic cells may be one of the reasons leading to insensitive to chemotherapy of the cells. Survivin gene can be used as a potential target for targeted chemotherapy of the disease.    ［KEY WORDS］Survivin gene;   leukemia;   polymerase chain reaction    Survivin基因是凋亡抑制蛋白家族的新成员之一,在细胞增殖与凋亡调控中起着枢纽作用,是联系细胞周期和细胞凋亡界面的重要因子［1］。已发现在大多数肿瘤组织中Survivin基因广泛表达［2］。近年研究表明,Survivin基因在不同血液肿瘤细胞中均有不同程度表达［3,4］,在恶性血液病的早期诊断、预后判断及指导临床治疗等方面具有重要意义。本研究旨在观察Survivin基因在急性白血病（AL）病人白血病细胞表达,并分析其与预后关系。

1  资料与方法

    1.1  一般资料

    急性白血病病人62例，男47例,女15例,年龄14～69岁,中位年龄40岁。按MICM分型诊断。62例病人中急性非淋巴细胞白血病（ANLL）45例(M1 5例,M2 20例,M3 12例,M4 2例,M5 6例),急性淋巴细胞白血病（ALL）17例(L1 9例,L2 8例)。包括初治病人38例,复发病人14例,缓解病人10例。缓解病人中2例系由初诊病人转化而来。所有初诊ALL病人采用VDP(长春新碱、柔红霉素、泼尼松)或VDCP(长春新碱、柔红霉素、环磷酰胺、泼尼松)方案治疗;ANLL病人采用HA(高三尖杉酯碱、阿糖胞苷)或DA(柔红霉素、阿糖胞苷)方案治疗，M3病人采用全反式维甲酸(ATRA)治疗。对照组10例,男6例,女4例,年龄18～55岁,中位年龄39.5岁，均为健康人。

    1.2  标本处理

    无菌操作取骨髓液2 mL,肝素抗凝,FicoLL液(相对密度1.077)分离单个核细胞(MNC),MNC比例大于80%,锥虫蓝拒染率大于99%,取约5×106个细胞,PBS洗涤2次,加TrizoL液1 mL,混匀后-20 ℃保存,待提取RNA。

    1.3  总RNA提取

    按Invitrogen公司试剂盒说明书操作步骤进行。使用紫外分光光度计测定RNA纯度(A260/A280>1.6),同时进行RNA定量。

    1.4  cDNA合成

    取2 μg RNA,OLigo (dT)18 primer 1 μL,用DEPC处理水补至12 μL,70 ℃下放置5 min。冰上骤冷后,加5×缓冲液4 μL,10 mmoL/L dNTPs 1  μL,RNA酶抑制剂20 U,37 ℃ 5 min,MMuLV逆转录酶(BBI公司)20 U,反应体系20 μL,37 ℃反应1 h,70 ℃ 下放置10 min,终止反应。

    1.5  PCR扩增

    Survivin正义链:5′CTTTCTCAAGGACCAC

    CGCATC3′,反义链:5′CAATCCATGGCAGCCAGCTGC3′,目的基因长度为393 bp。βacting正义链:5′CGCTGCGCTGGTCGACA3′,反义链:5′GTCAGGCACGATTTCCCGCT3′,目的基因长度为619 bp。反应体系包括:Survivin正、反义链引物各10 pmoL,10 mmol/L dNTPs 0.5 μL,10×缓冲液2.5 μL,25 mmol/L MgCl2 1.5 μL,Taq DNA聚合酶1.0 U,RT产物2 μL,总体系25 μL。预实验确定产物与循环之间呈线性关系。PCR条件:94 ℃预变性5 min；然后94 ℃变性50 ｓ,60 ℃复性1 min,72 ℃延伸1 min,38个循环。同时，行βacting测定作为内参照。

    1.6  PCR产物分析

    取PCR产物10 μL在15 g/L琼脂糖凝胶中电泳，85 V电泳45～60 min。阳性结果可见393 bp与 619 bp处各有一条亮带，分别为Survivin和βacting。用吸光度扫描仪扫描并照相，照片经Metamorph Imaging Sight软件进行分析并读取吸光度值，取Survivin/βacting吸光度比值进行半定量,各标本重复2次,取平均值。

    1.7  统计学处理

    计数资料采用χ2检验，多个样本均数比较用方差分析,所有数据均用SPSS 11.5统计软件处理。

    2  结    果

    2.1  Survivin mRNA在AL细胞的表达

    ALL病人的阳性表达率为76.47%(13/17)，ANLL病人表达阳性率为71.11%(32/45)，二者均高于对照组的20.00%(2/10),差异有统计学意义（χ2=6.01、7.02，P<0.05）。但ALL与ANLL比较无统计学差异。ALL、ANLL病人及对照组Surviving/βacting半定量结果分别为0.68±0.18、0.73±0.14、0.30±0.04，ALL与ANLL细胞Survivin mRNA表达水平均高于对照组（F=7.80,q=4.70、5.54，P<0.05）。

    2.2  AL病人不同时期Survivin mRNA表达

 初治组和复发组病人Survivin表达阳性率分别为78.95%、85.71%，均高于对照组(χ2=12.77、9.77，P<0.05)，复发组、初治组与缓解组相比差异也具有统计学意义（χ2=6.69、5.53,P<0.05），缓解组与对照组相比差异无统计学意义。

    2.3  Survivin mRNA表达与化疗效果的关系

    Survivin mRNA表达阴性者接受1个疗程化疗后骨髓缓解率（BMR）为77.78%（7/9）,明显高于阳性表达者的31.03%（9/29）,二者相比有统计学意义（χ2=4.39，P<0.05）。

    3  讨    论

    Survivin基因是迄今发现的最强的凋亡抑制因子,位于17q25,结构较为独特,仅含有单一的杆状病毒IAP重复序列功能区。研究表明,激活细胞内半胱氨酸蛋白酶caspase系列是细胞凋亡的共同途径。caspase活化有两条途径：一是TNF家族成员Fas(CD95)激活近端的caspase,特别是caspase8；另一是bax过度表达诱发线粒体释放细胞色素C,激活caspase9,caspase9又激活下游的caspase3和caspase7。Survivin抑制由Fas/caspase8、bax/cytc诱导的caspas激活,特异性阻断终末效应细胞死亡,从而抑制细胞凋亡［5,6］。

    Survivin基因主要表达在各种凋亡调节器官的胚胎发育期,而在正常成人的器官则检测不到,但当细胞恶变为肿瘤细胞时,Survivin基因又将会重新表达。它在乳癌、肺癌、结肠癌、高度恶性的非霍奇金淋巴瘤中均高度表达,并与预后相关［6］。CATER等［7］研究AML细胞系和18例初发AML病人中Survivin基因的表达情况,发现全部AML细胞系和16例AML病人中有Survivin基因的表达,而正常CD34+细胞及外周血单个核细胞则无表达,而且Survivin基因高表达白血病病人完全缓解率低于阴性病人,预后亦较差。本文的研究结果表明,大部分AL病人表达Survivin mRNA,而且,无论是Survivin mRNA表达阳性率还是半定量后的Survivin mRNA表达水平AL病人均高于对照组,与文献报道一致［8,9］。ALL细胞Survivin基因阳性表达有高于ANLL的趋势，但它们之间并无统计学差异。同时,结果还显示,初治及复发AL病人Survivin mRNA表达水平均高于对照组，而缓解组与对照组无差别，说明Survivin表达在白血病细胞的增殖分化和(或)抗凋亡过程中发挥了重要作用。AL病人白血病细胞中，Survivin mRNA表达阴性者接受1个疗程化疗后骨髓缓解率明显高于阳性表达者,因此，Survivin基因可能是导致AL细胞对化疗药物不敏感的原因之一，Survivin基因可作为靶向白血病治疗的一个潜在靶点。

【参考文献】  ［1］BADARAN A, YOSHIDA A, ISHIKAWA K, et al. Identification of anovelsplice variant of the human antiapoptosis gene Survivin［J］. Biochem Biophts Res Com mun, 2004,13:902907.

［2］马锴,沈毅. Survivin和c2myc在食管鳞癌组织表达及其意义 ［J］. 齐鲁医学杂志, 2006,21(2):106108.

［3］管洪在，乔宏. 降钙素基因高度甲基化与恶性血液病预后关系 ［J］. 青岛大学医学院学报, 2000,36( 4):243245.

［4］CONG X L, HAN Z C, INT J, et al. Survivin and leukemia［J］. Hematol, 2004,80:232238.

［5］TAMM I, WANG Y, SAUSVILLE E, et al. IAPfamily protein Survivin inhibits caspase activity and apoptosis induced by Fas (CD95), Bax, caspases, and anticancer drugs ［J］. Cancer Res, 1998,58(10):53155320.

［6］LI F, AMBROSINI G, CHU E Y, et al. Control of apoptosis and mitotic spindle check point by Survivin ［J］. Nature, 1998,396(6711):580584.

［7］CATER B Z, MILETLA M, ALTIERI D C, et al. Cytokineregulate expression of Survivin in myeloid leukemia ［J］. Blood, 2001,9(9):27842790.

［8］林茂芳,孟小莉,蔡真,等. 抗凋亡基因Survivin在急性白血病细胞表达及其临床意义 ［J］. 中华血液学杂志, 2002,5:251253.

［9］ADIDA C, RECHER C, RAFFOU X, et al. Expression and prognostic significance of Survivin in de novo acute myeloid leukaemia［J］. Br J Haematol, 2000,111:196203.